Studio sperimentale su stipiti di Legionella spp. isolati da acque destinate al consumo umano Valutazione delle cariche batteriche a seguito di inoculo in acqua sterile ed applicazione a tempi successivi della tecnica di filtrazione su membrana secondo la UNI EN ISO 11731:2017

The diffusion of Legionella spp. it is currently an extremely topical issue on which it is important to focus attention. The gold standard for the identification and enumeration of this bacterial genus is represented by the cultivation method identified by the UNI EN ISO 11731: 2017 standard. In this case, the UNI EN ISO 11731: 2017 standard recommends the processing of samples in the shortest possible time and in any case no later than 48 hours after sampling. However, if we consider the dynamics of a laboratory that carries out routine investigations, the transport phases of the samples that may be subject to delays and slowdowns, and the prospect of the transposition of the EU Directive 2020/2184, which includes Legionella among the "relevant parameters for risk assessment of domestic distribution systems ”, these are very stringent time limits, which on several occasions would make the execution of the analysis invalid. A strategy was therefore devised aimed at optimizing and making the processing of water samples more manageable, so the reference standard is not free from complications from a technical-analytical point of view and imposes restrictive times. Therefore, the work here has as its objective an experimentation, carried out with the use of wild strains bacterial strains of Legionella spp., Aimed at outlining improvement implications regarding the methods referred to by UNI EN ISO 11731: 2017. During the course of the experiments, tests were in fact carried out to evaluate the trend of the Legionella charge from the moment of inoculation at 96h, to test its survival in the processing phase and the percentage of physiological loss over the days, to demonstrate that it is compatible with a proposal to extend the time limits imposed by the reference UNI EN ISO. In view of the charge studies, comparisons between the filter membranes required by the standard were also developed, to highlight a different filtration efficiency depending on the size of the pores, the material but also the Legionella strains themselves. The recorded data shows a recovery of a significant number of legionellae and the possibility of numbering at 72h, while at 96h the charge is still considered acceptable. In light of the data obtained through the development of experimental tests, it would therefore be possible to extend the time limit beyond the 48h recommended by the reference standard where the laboratory management of routine analyzes should require it. In addition, the tests show a different attitude to the filtration process of atypical Legionella compared to Legionella pneumophila, for which it would be necessary to take some precautions, among which it would be preferable to use a 0.20 μm polyethersulfone filter that maximizes its recovery.

La diffusione di Legionella spp. è ad oggi una tematica di estrema attualità su cui è importante focalizzare l’attenzione. Il gold standard per l’identificazione e l’enumerazione di tale genere batterico è rappresentato dal metodo colturale individuato dalla norma UNI EN ISO 11731:2017. Nella fattispecie, la norma UNI EN ISO 11731:2017 raccomanda il processamento dei campioni nel più breve tempo possibile e comunque entro e non oltre le 48h dal prelievo. Tuttavia, se si considerano le dinamiche di un laboratorio che effettua indagini di routine, le fasi di trasporto dei campioni che possono subire ritardi e rallentamenti, e la prospettiva del recepimento della Direttiva UE 2020/2184, che inserisce Legionella tra i “parametri pertinenti per la valutazione del rischio dei sistemi di distribuzione domestici”, si tratta di limiti temporali assai stringenti, che in più occasioni renderebbero invalidabile l’esecuzione stessa dell’analisi. Si è pertanto pensata una strategia volta ad ottimizzare e rendere più gestibile la processazione dei campioni di acqua, per cui la norma di riferimento non è scevra da complicanze sotto il profilo tecnico-analitico e impone delle tempistiche restrittive. Pertanto, il lavoro in questa sede si pone come obiettivo una sperimentazione, posta in essere con l'impiego di ceppi batterici wild strains di Legionella spp., finalizzata a delineare risvolti migliorativi a proposito dei metodi richiamati dalla UNI EN ISO 11731:2017. Durante il corso delle sperimentazioni sono infatti state effettuate delle prove per valutare l’andamento della carica di Legionella dal momento dell’inoculo a 96h, per testarne la sopravvivenza in fase di processamento e la percentuale di perdita fisiologica nell’arco dei giorni, per dimostrare che essa sia compatibile con una proposta di estensione dei limiti temporali imposti dalla UNI EN ISO di riferimento. Nell’ottica degli studi sulla carica sono inoltre stati messi a punto dei confronti tra le membrane filtranti previste dalla norma, per evidenziare una differente efficienza di filtrazione in funzione della dimensione dei pori, del materiale ma anche degli stessi ceppi di Legionella. Dai dati registrati si osserva un recupero di un numero rilevante di legionelle e la possibilità di numerazione a 72h, mentre a 96h la carica si considera comunque accettabile. Alla luce dei dati ottenuti mediante la messa a punto di prove sperimentali sarebbe pertanto possibile estendere il limite temporale oltre le 48h raccomandate dalla norma di riferimento laddove la gestione laboratoristica delle analisi di routine dovesse necessitarne. Inoltre dai test emerge una diversa attitudine al processo di filtrazione delle legionelle atipiche rispetto a Legionella pneumophila, per cui si renderebbe necessario prendere alcuni accorgimenti, tra cui sarebbe preferibile l’utilizzo di un filtro in polietersulfone da 0,20 μm che ne massimizzi il recupero.