Un approccio terapeutico innovativo per stimolare la secrezione di collagene in forme recessive di osteogenesis imperfecta

Osteogenesis imperfecta (OI) or brittle-bone disease is a group of heritable rare collagenopathies affecting collagen type I, that are characterized by reduced bone mineral density and increased bone fragility. OI types VII and VIII are caused by recessive mutations in cartilage-associated protein (CRTAP) and prolyl-3- hydroxylase 1 (P3H1), respectively, encoding for the components of the endoplasmic reticulum (ER) complex responsible for the 3-hydroxylation of specific proline residues in type I collagen. Mutations in the proteins of the complex are characterized by the synthesis of overmodified collagen. Overmodified collagen is partially intracellularly retained causing ER stress and altered cell homeostasis and partially extracellularly secreted and assembled in fibrils associated with impaired mineralization. No cure is available for the disease. Thus, the search for new therapy is an urgent patient need. Here we used three primary fibroblast lines obtained from recessive OI type VII and VIII patients to test the therapeutic effect of heat shock protein 47 (HSP47). HSP47 is a highly conserved ER-resident collagen specific chaperone, a key endogenous player in collagen folding, stability and secretion. HSP47 treatment slightly reduced the collagen overmodification, suggesting the chaperone positive contribution to collagen folding, and increased collagen secretion and matrix incorporation in all the cell analyzed. Furthermore, it ameliorated OI cell morphology and significantly reduced the protein intracellular accumulation. Importantly, a strong reduction of ER collagen retention was achieved upon treatment. In order to investigate the efficacy of exogenous HSP47 on the bone phenotype, we took advantage of the zebrafish of p3h1-/- model available in the lab. The in vivo HSP47 treatment of p3h1-/- embryos performed for 11 days improved bone mineralization. Thus, our data indicate that HSP47 treatment positively affects collagen folding, secretion and improves bone mineralization.

L'osteogenesi imperfetta (OI) o malattia delle ossa fragili è un gruppo fenotipicamente e geneticamente eterogeneo di displasie ereditarie del collagene di tipo I caratterizzate da una ridotta massa ossea e da un'aumentata fragilità ossea, che causano una predisposizione alle fratture. L’OI di tipo VII e VIII sono causate da mutazioni recessive nei geni codificanti la proteina associata alla cartilagine (cartilage-associated protein, CRTAP) e la prolil 3- idrossilasi 1 (P3H1), rispettivamente, due componenti del complesso del reticolo endoplasmatico (RE) responsabili della 3-idrossilazione di specifici residui di prolina nel collagene di tipo I. Le mutazioni nelle proteine del complesso causano sintesi di collagene over-modificato. Quest’ultimo viene in parte trattenuto a livello intracellulare, causando stress del RE e alterazione dell'omeostasi cellulare, e in parte secreto a livello extracellulare e assemblato in fibrille associate a un'alterata mineralizzazione. Non esistono cure per questa malattia, pertanto è necessaria la ricerca di una nuova terapia per il benessere dei pazienti. L’Heat Shock Protein 47 (HSP47) è uno chaperone specifico del collagene di 47 kD residente nel RE e appartiene alla superfamiglia degli inibitori della serina proteasi (serpin). È coinvolto nella biosintesi del collagene e svolge un ruolo fondamentale nel ripiegamento, nella stabilità e nel trasporto intracellulare delle triple eliche di procollagene. Dato che è stato dimostrato che il trattamento con HSP47 esogeno aumenta specificamente la deposizione di collagene in vitro in fibroblasti wild type, e ripristina la capacità delle cellule di depositare collagene in cellule knock out per HSP47, abbiamo pensato di testare HSP47 come trattamento per stimolare la secrezione di collagene e migliorare il fenotipo nell’OI. In particolare, abbiamo testato l'effetto terapeutico di HSP47 in tre linee primarie di fibroblasti ottenuti da pazienti affetti da OI recessiva di tipo VII e VIII. Il trattamento delle cellule OI con HSP47 si è dimostrato efficace nel ridurre parzialmente l’over-modificazione del collagene, indicando il contributo positivo di questo chaperone nel ripiegamento del collagene. Il trattamento ha inoltre aumentato la secrezione di collagene e la sua incorporazione nella matrice extracellulare in tutte le cellule analizzate. Inoltre, ha migliorato la morfologia delle cellule affette da OI e ha ridotto significativamente l'accumulo intracellulare di proteine. È importante notare che con il trattamento si è ottenuta una forte riduzione della ritenzione di collagene nel RE. Per testare HSP47 in vivo, direttamente nel tessuto osseo, ci siamo successivamente avvalsi del modello zebrafish. Quest’ultimo è sfruttato come modello per lo studio delle malattie scheletriche umane poiché condivide le componenti scheletriche di base e le vie osteoblastogeniche di differenziamento. Inoltre, la trasparenza dell’embrione, la rapida velocità di sviluppo, la piccola dimensione e l’elevata offspring fanno del pesce un buon modello per lo screening farmacologico. Abbiamo, dunque, valutato l'effetto di HSP47 sulla mineralizzazione ossea in vivo in un modello di zebrafish di OI recessiva di tipo VIII (knock out per p3h1), generato nel nostro laboratorio tramite il sistema CRISPR/Cas9. p3h1-/- zebrafish presenta dimensioni ridotte, sproporzioni corporee ed una ritardata mineralizzazione ossea. Il trattamento con HSP47 che abbiamo effettuato ha migliorato significativamente la mineralizzazione dell'osso ceratoiale, dimostrando quindi anche in vivo il suo potenziale farmacologico per l’OI. Pertanto, la capacità di HSP47 di chaperone specifico per il collagene ed il suo ruolo nella secrezione, ne fanno una scelta terapeutica interessante per ridurre l'accumulo di collagene intracellulare nelle cellule affette da OI e per stimolarne la secrezione in matrice dov’è necessario.