Validazione di nanoparticelle funzionalizzate dirette alla Proteina Traslocatrice da 18 kDa (TSPO) per l'internalizzazione specifica nella microglia reattiva

Reactive microgliosis is a distinct hallmark of neuroinflammation, which is a common feature of many neurological disorders, neurodegenerative diseases and CNS injury. Reactive microgliosis is characterized by an increase in the expression of the 18 kDa translocator protein (TSPO): ligands of this protein are used in the clinic to monitor the state of neuroinflammation using PET. In this thesis, nanoparticles functionalized with the TSPO ligand PBR28 are validated in a microglia-like murine cell line (BV2). The cell line is initially immunolabeled to verify the expression of TSPO and its functionality in response to stimulation with bacterial lipopolysaccharide (LPS). Subsequently, the cell line is transduced to express the human form of TSPO, fused at the C-terminus with the Green Fluorescent Protein (GFP), in order to easily visualize the expression of TSPO and its distribution on the mitochondrial network, in addition to colocalization with nanoparticles. The transduced cell line is then used to validate the functionalization of the nanoparticles, both in flow cytometry and in fluorescence microscopy. Functionalized nanoparticles demonstrate a higher degree of internalization and colocalization with the mitochondrial network, compared to non-functionalized nanoparticles. Finally, we set a protocol for expansion microscopy, a technique of super-resolution microscopy, which increases the sample size up to five times, exceeding the optical resolution limit of microscopes. This technique allows to evaluate with greater precision the distribution of nanoparticles within the cell and, possibly, to obtain a higher precision while evaluating the degree of colocalization with the proteins or organelles of interest.

La microgliosi reattiva è un segno distintivo della neuroinfiammazione, tratto comune a vari disordini neurologici, malattie neurodegenerative e traumi al sistema nervoso centrale. La microgliosi reattiva è caratterizzata da un aumento dell’espressione della proteina traslocatrice da 18 kDa (TSPO): ligandi di questa proteina vengono utilizzati in clinica per monitorare lo stato della neuroinfiammazione tramite PET. In questa tesi, nanoparticelle funzionalizzate con il ligando di TSPO PBR28 vengono validate in una linea cellulare murina simil-microgliale (BV2). La linea cellulare viene inizialmente immunomarcata per verificare l’espressione di TSPO e la sua funzionalità a livello basale in risposta a stimolazione con lipopolisaccaride batterico (LPS). Successivamente, la linea cellulare viene trasdotta per esprimere la forma umana di TSPO, fusa al C-terminale con la Green Fluorescent Protein (GFP), al fine di visualizzare facilmente l’espressione di TSPO e la sua distribuzione sul network mitocondriale, oltre alla colocalizzazione con le nanoparticelle. La linea cellulare trasdotta viene quindi utilizzata per validare la funzionalizzazione delle nanoparticelle, sia in citofluorimetria, sia in microscopia a fluorescenza. Le nanoparticelle funzionalizzate dimostrano un maggior grado di internalizzazione e di co-localizzazione con il network mitocondriale, rispetto alle nanoparticelle senza funzionalizzazione. Infine, viene messo a punto un protocollo di microscopia a espansione, una tecnica di super-risoluzione per la microscopia, che permette di aumentare le dimensioni del campione fino a cinque volte, superando il limite ottico di risoluzione dei microscopi. Questa tecnica permette di valutare con maggior precisione la distribuzione delle nanoparticelle all’interno della cellula e, eventualmente, di aumentare la precisione nel valutare la co-localizzazione con le proteine o gli organelli di interesse.