Studio di un sito di legame criptico nella Spike protein di SARS-CoV-2 conservato in diverse varianti: metodi computazionali per il design di ligandi attivi.

During the last couple years, Severe Acute Respiratory Syndrome 2 (SARS) coronavirus spread worldwide, causing severe disease conditions and even death of more than 6 million people as of June 2022. Since its outbreak, many variants of SARS-CoV-2 have emerged; these variants bear numerous mutations, especially in the receptor binding domain (RBD) of the Spike protein, located on the surface of the virus and representing the first point of contact with the host and the human immune system. Mutations led in some cases to higher infectivity and immune evasion; as a consequence, the current therapies available (such as vaccines) show reduced effectiveness for some variants. Recent studies showed the presence of three cryptic binding pockets (one for each protomer), which can accommodate a linoleic acid (LA) molecule; furthermore, in the presence of LA, the locked conformation of the spike glycoprotein is stabilized, reducing the binding between the receptor binding motif (RBM) and the ACE2 receptor. These pockets are located at the interfaces between two protomers and are characterized by a high number of hydrophobic and aromatic residues; Arg408 and Gln409 from the adjacent protomer have been identified as anchor residues that interact with the carboxylic moiety of LA, stabilizing the molecule in the pocket. However, these features are not enough to guarantee LA binding; in fact, structural data indicate the need for a gating helix to be displaced by ~ 6 Å in order to open the pocket. Our work focused in investigating the druggability of this site and determining whether the free fatty acid binding pocket is conserved among different SARS-CoV-2 variants. Firstly, we identified a frame from the 4 μs Molecular Dynamics (MD) simulations of the fully glycosylated Spike protein of the D614G variant, with features comparable to those needed for the LA binding. Then we developed a minimization protocol that mimics the displacement of the helix, which allowed us to correctly re-dock the LA molecule inside our structure and validate our computational protocol. Next, we used the same structure to screen three libraries of compounds: two were made up of small, drug-like molecules, whereas the last one was made up of fragments. Docking experiments helped us select molecules as possible candidates for binding the selected pocket on the target; furthermore, we selected combinations of fragments that could be a starting point for a fragment-linking strategy aimed at creating novel chemotypes. The same libraries were then screened using structures that bear the mutation at K417, which is the only mutation found inside the FFBP among the current variants of concern (VOCs); the docking results did not change dramatically in the mutated structures, suggesting that some highly ranked compounds could exhibit the ability to target different variants. Finally, we analysed the MD simulation of different variants to assess the opening of the FFBP during the simulation time: results showed that in some variants there are frames which resemble the experimental cryo-EM complex, suggesting that the FFBP might indeed be a generally conserved druggable site. Overall, in this work I have developed a new computational protocol to investigate the druggability of a functionally relevant, conserved pocket in the SARS-CoV-2 Spike protein. This knowledge was then used to select and design potential active inhibitors that are now being tested experimentally.

Nel corso degli ultimi anni, il virus SARS-CoV-2 si è diffuso in tutto il mondo, provocando gravi sintomi e ad oggi, ha causato la morte di più di 6 milioni di persone. A partire dalla sua iniziale diffusione, si sono sviluppate molte varianti; queste presentano numerose mutazioni, in particolare nel receptor binding domain (RBD) della proteina Spike, che si trova sulla superficie del virus e rappresenta il primo punto di contatto con l’ospite ed il sistema immunitario umano. In alcuni casi, le mutazioni hanno portato a maggiore infettività ed evasione dal sistema immunitario; di conseguenza, le attuali terapie disponibili (ad esempio i vaccini) presentano minore efficacia nei confronti di alcune varianti. Studi recenti hanno dimostrato la presenza di tre siti di legame criptici (uno per ciascun protomero), che possono alloggiare una molecola di acido linoleico; inoltre, in presenza del ligando, la conformazione chiusa della glicoproteina Spike viene stabilizzata, riducendo così il binding tra il receptor binding motif (RBM) e il recettore ACE2. Queste tasche sono posizionate all’interfaccia tra due protomeri e sono caratterizzate da un alto numero di amminoacidi aromatici e idrofobici; i residui Arg408 e Gln409 del protomero adiacente sono stati identificati come residui ancora che interagiscono con la porzione carbossilica dell’acido linoleico, stabilizzando il ligando. Nonostante ciò, queste caratteristiche non sono sufficienti per assicurare il binding del ligando; infatti, dati sperimentali indicano che l’alfa elica presente nella tasca deve spostarsi di circa 6 Å, per aprire la tasca stessa. Il nostro lavoro si è concentrato nello studio della druggability (ovvero nella capacità di un sito di interagire con un farmaco) della tasca e nel determinare se il sito di legame è conservato in diverse varianti di SARS-CoV-2. Abbiamo identificato una conformazione con caratteristiche comparabili con la struttura sperimentale, a partire da una simulazione di dinamica molecolare (MD) di 4 μs della glicoproteina Spike della variante D614G. In seguito, abbiamo sviluppato un protocollo di minimizzazione che mima lo spostamento dell’elica, che ci ha permesso di effettuare esperimenti di docking con l’acido linoleico all’interno della nostra struttura e validare il protocollo. Abbiamo poi utilizzato la stessa struttura per effettuare esperimenti di high throughput virtual screening con tre librerie di composti (due composte da molecole drug-like e una da frammenti). Grazie ai risultati del docking abbiamo selezionato delle molecole che mantengono le interazioni chiave dell’acido linoleico e di conseguenza potrebbero essere possibili candidati per interagire nel sito di legame; inoltre, abbiamo selezionato combinazioni di frammenti che potrebbero essere un punto di partenza per sintetizzare farmaci secondo un approccio fragment-based. Le stesse librerie sono state utilizzate per esperimenti HTVS su strutture che presentano una mutazione dell’amminoacido K417, che è l’unica mutazione nella regione investigata nelle attuali varianti di interesse; i risultati del docking non sono cambiati drammaticamente nelle strutture mutate, suggerendo quindi che alcuni composti che hanno ottenuto buoni risultati potrebbero essere in grado di interagire con diverse varianti. In fine, abbiamo analizzato le simulazioni di dinamica molecolare di alcune varianti per determinare l’eventuale apertura della tasca durante i tempi di simulazione: i risultati indicano la presenza di alcune conformazioni comparabili con la struttura sperimentale in alcune varianti, suggerendo che il sito investigato è conservato. Per concludere, in questo lavoro ho sviluppato un nuovo protocollo computazionale per investigare la druggability di un sito di legame conservato in diverse varianti. Questo studio è stato utile per selezionare possibili inibitori, che al momento sono in fase di test.