Characterization of small molecules with epigenetic activity modulating the HDAC6 deacetylation function

Histone acetylation and histone deacetylation, performed by HAT and HDAC enzymes, are essential epigenetic mechanisms that remodel chromatin structure and alter gene expression. In the worst cases, these epigenetic modifications, if they target specific regions in the genome or specific non-histone proteins, can lead to several diseases, including tumor development. HDAC6 has many roles in biological pathways, such as tubulin deacetylase activity (TDAC). Moreover, HDAC6 has become an important target for treating cancer due to its significant contribution to the oncogenic pathway. The present study concerns the characterization of small molecules with epigenetic activity modulating the HDAC6 deacetylation function, particularly regarding their antitumor properties. Specifically, two molecules, namely ITF3756 and ITF5135, with HDAC6 inhibitor function, have been tested at different concentrations on different cellular models: human breast cancer HCC1806 cell line, wild type (WT) line, and Knock Out (KO) for HDAC6 murine melanoma B16F10, and human T cell leukemia Jurkat cell line. A decrease in the tumor cells' proliferative capacity was observed after the inhibition of HDAC6. In this condition, quantifying pre- and post-treatment histone modifications via immunofluorescence staining, capillary electrophoresis, and ELISA assays revealed a surprising outcome. Overall, the inhibition of HDAC6 led to an increase in acetylated Lys9, Lys27, and Lys14 on histone H3, while the Lys16 on histone H4 followed an opposite trend. Furthermore, multi-omic analysis (ATAC-seq and ChIP-Seq analyses, transcriptomics, proteomics) demonstrated that the treatment with the HDAC6 inhibitory drugs led to chromatin remodeling, with the consequent modulation of gene expression, protein synthesis, and cellular pathways. For example, genes listed in the biological processes, cellular components, and molecular functions were diversely down or up-regulated after the inactivation of HDAC6. Future perspectives expect a more detailed analysis of the interaction dynamics between HDAC6 and the corresponding inhibitors, as well as a more detailed analysis of multi-omics on multiple cell lines, to analyze in detail the effects given by the inhibition of HDAC6. Moreover, a specific organ analysis is foreseen regarding histone modifications on WT and HDAC6_KO mouse tissues.  

Caratterizzazione di nuove molecole ad attività epigenetica modulanti la funzione di deacetilazione di HDAC6. L’acetilazione e la deacetilazione degli istoni, eseguite dagli enzimi HAT e HDAC, sono meccanismi epigenetici essenziali che portano al rimodellamento della struttura cromatinica e alterano, di conseguenza, l’espressione genica. Nel peggiore dei casi, queste alterazioni epigenetiche, possono colpire regioni specifiche del genoma, o specifiche proteine non istoniche, causando lo sviluppo di diverse malattie, tra cui la nascita di tumori. HDAC6 ricopre diversi ruoli nei processi biologici; fra le sue varie funzioni, HDAC6 svolge anche un’attività deacetilasica della tubulina (TDAC). A causa del suo contributo significativo nei processi di oncogenesi, HDAC6 è diventato un bersaglio importante per lo sviluppo di terapie oncologiche. L’obiettivo di questo studio consiste nella caratterizzazione di piccole molecole ad attività epigenetica che modulano la funzione deacetilasica di HDAC6, in particolare per quanto riguarda le loro proprietà antitumorali. Nello specifico, due molecole, l’ITF3756 e l’ITF5135, le quali possiedono una funzione HDAC6-inibitoria, sono state testate a varie concentrazioni su diversi modelli cellulari: la linea cellulare di carcinoma mammario umano HCC1806, le linee cellulari di melanoma murino B16F10 wild type (WT) e Knock Out (KO) per HDAC6 e la linea cellulare umana Jurkat di leucemia linfoblastica acuta di tipo T. In seguito all’inibizione di HDAC6, è stata osservata una diminuzione nella capacità proliferativa delle cellule tumorali. In questa condizione, la quantificazione delle modifiche istoniche pre- e post-trattamento, mediante colorazione con immunofluorescenza, elettroforesi capillare e saggi ELISA, ha rivelato un risultato sorprendente. Complessivamente, l’inibizione di HDAC6 ha portato ad un aumento dell’acetilazione delle Lys9, Lys27 e Lys14 sull’istone H3, mentre la Lys16 sull’istone H4 risulta seguire un andamento opposto. Inoltre, l’analisi multi-omica (analisi ATAC-seq e ChIP-Seq, trascrittomica e proteomica) ha dimostrato che il trattamento con l’inibitore di HDAC6, ITF3756, ha portato al rimodellamento della struttura cromatinica, con conseguente modulazione dell’espressione genica, della sintesi proteica e di vari processi cellulari. Ad esempio, alcuni geni concernenti i processi biologici, le componenti cellulari e le funzioni molecolari sono stati variamente regolati in seguito all’inattivazione di HDAC6 nel modello murino di B16F10. In futuro sarà opportuna un’analisi più dettagliata delle dinamiche di interazione tra l’inibitore e HDAC6, così come un’analisi multi-omica più dettagliata su altre linee cellulari, per analizzare nel dettaglio gli effetti dati dall’inibizione di HDAC6. Inoltre, è prevista un’analisi specifica delle modificazioni istoniche sui tessuti murini esportati da topi WT e HDAC6_KO.