Formulazione di nanoparticelle di sericina per la rigenerazione del disco intervertebrale

Intervertebral disc degeneration is an oxidative and inflammatory pathological condition that induces viability and functionality reduction of Nucleus Pulposus cells. Cellular therapies were previously proposed to repair and substitute the herniated disc, but low proliferative index and pathological conditions of Nucleus Pulposus cells dramatically reduced the efficacy of this approach. In this work a therapeutic system based on silk sericin and crocetin nanoparticles has been developed. Silk sericin is a water soluble protein, therefore cannot be used by itself for nanoparticle formulation, but it requires a cross-linker component. In this work crocetin has been proposed to assolve this purpose, besides its cross-linking features also acts as an active substance. These two delivery system components possess many biological activities: ROS-scavenging, anti-inflammatory and immunomodulatory properties. By spray-drying nanoparticles, microparticles including nanosystems has been obtained. Three formulations containing a variety of nanoparticle (NPs) concentrations (w/w%) were prepared and tested: Micro1 conteining 100% of NPs, Micro2 composed by 50% of NPs and 50% of excess of sericin, and Micro3 prepared with 20% of NPs and 80% of excess of crocetin/crocin solution. Formulations were tested to evaluate ROS-scavenging, anti-elastase and anti-tyrosinase activities; in vitro assais were peformed in order to demonstrate potential citotoxicity against nucleus pulposus cells and to test cytoprotection against oxidative stress in mesenchymal stem cell. Results showed that Micro1 formulation has a dose-dependent activity for each tested condition; Micro2 formulation revealed the highest anti-elastase activity which can be linked to sericin excess; finally Micro3 formulation displayed an high ROS-scavenging and anti-tyrosinase activity, due to crocetin excess. Moreover all formulations demonstrated citycompatibility and showed cellular protection against oxydative stress. The drug delivery systems developed in this work proved to be good candidates for the local treatment of inflammatory conditions caused by intervertebral disc degeneration. The NPs obtained can be empoyed as drug delivery systems, as well as bioactive compounds able to modulate the damage-dependent tissue inflammation and protect intervertebral disc cells.

La degenerazione del disco intervertebrale è una condizione patologica ossidativa e infiammatoria che induce la riduzione della vitalità e della funzionalità delle cellule del nucleo polposo. Le terapie cellulari proposte in letteratura hanno lo scopo di riparare e sostituire il disco degenerato, ma il basso indice proliferativo e le condizioni patologiche delle cellule del nucleo polposo riducono drasticamente l'efficacia di questo approccio. In questo lavoro è stata messa a punto una formulazione di nanoparticelle a base di sericina della seta e crocetina. La sericina della seta è una proteina idrosolubile che non può essere utilizzata da sola per l’allestimento di nanoparticelle e, per questo motivo, è stata associata alla crocetina che funge sia da cross-linker che da molecola bioattiva. I due componenti del sistema di drug delivery sviluppato in questa tesi mostrano numerose attività biologiche quali attività anti-ossidante, anti-infiammatoria e immunomodulante. Le nanoparticelle allestite sono state sottoposte a processo di spray drying al fine di ottenere microparticelle contenenti i nanosistemi. Sono state preparate e testate tre formulazioni contenenti diverse quantità di nanoparticelle (NPs): Micro1 contenenti il 100% di NPs, Micro2 contenenti il 50% di NPs e il 50% di sericina in eccesso, e Micro3 preparate con il 20% di NPs e l’80% di eccesso di soluzione di crocetina/crocina. Le tre formulazioni sono state testate per valutarne l’attività antiossidante, anti-elastasica e anti-tirosinasica; test in vitro sono stati effettuati per determinare l’eventuale citotossicità delle micro e nanoparticelle nei confronti di cellule del nucleo polposo e, infine, il potere protettivo dei sistemi di drug delivery nei confronti dei danni indotti dallo stress ossidativo su cellule del nucleo polposo umane. Dai risultati è emerso che la formulazione Micro1 ha un’attività dose-dipendente per tutte le attività testate; la formulazione Micro2 si è rivelata la più attiva nei test per l’attività anti-elastasica e questo può essere giustificato dalla presenza della sericina in eccesso; la formulazione Micro3 ha mostrato un’elevata attività antiossidante e anti-tirosinasica dovuta alla presenza in eccesso della crocetina. Inoltre, tutte le formulazioni si sono dimostrate citocompatibili e capaci nella protezione delle cellule dai danni dello stress ossidativo. I sistemi di drug delivery allestiti risultano quindi essere dei buoni candidati per il trattamento in loco di condizioni infiammatorie tipiche della degenerazione del disco intervertebrale. Le nanoparticelle sviluppate in questo studio possono quindi essere utilizzate come sistemi di veicolazione di farmaci ma anche come sistemi bioattivi in grado di modulare esse stesse la condizione infiammatoria del tessuto danneggiato e di proteggere le cellule residenti del disco intervertebrale.