Identification and functional characterization of a novel alternatively spliced isoform of ERK5.

Alternative splicing (AS) is the post-transcriptional process that produces multiple transcripts from a single gene. This results in the expression of a variety of proteins with different functions, structure, cellular localization, and stability. AS regulation represents one of the major mechanisms to expand the coding potential of the human genome. Whereas AS is important to modulate several biological processes during development, its alteration directly contribute to cancer progression and therapeutic resistance. Eukaryotic kinases are fundamental proteins that participate in many cellular processes and are highly regulated by AS. Among different kinases, the Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) control signal cascades that mediate cellular responses to diverse stimuli (such as growth factors, chemical or osmotic stress). Extracellular-signal Regulated Kinase 5 (ERK5) is the last discovered member of this family and, differently from the other members, it contains a unique trans-activation domain (TAD), which allows it to directly activate transcription factors in response to different stimuli. ERK5 regulates cell proliferation, apoptosis, differentiation, and survival. Interestingly, an aberrant activity of ERK5 has been observed during tumor progression of many cancer types, such as bladder, breast, prostate, and colorectal cancers. More specifically, ERK5 atypical activity was linked to activation of many hallmarks of cancers, from sustained proliferation to cell death resistance. My thesis project was focused on the identification of a novel alternatively spliced transcript of human ERK5 gene. This variant, annotated in several public AS databases, is generated through the exclusion of ERK5 exon 2 and 3 from the mature mRNA. Due to the consequent loss of a portion of the N-terminal domain in the resulting protein, we called this variant ΔN-ERK5. In order or characterize the biological role of ΔN-ERK5, I cloned in a mammalian expression vector the cDNA encoding for this short protein and for the full-length isoform (FL-ERK5) fused with the FLAG tag. After transfection in Hek293 and HeLa cells, I evaluated by using immunofluorescence and confocal microscopy their localization. This allowed me to demonstrate that the ERK5 protein isoforms are characterized by a different localization, with FL-ERK5 exclusively detected in the cytoplasm while ΔN-ERK5 is localized both in the nucleus and cytoplasm. This result is in accordance with the different structures of the two isoforms, since ΔN-ERK5 isoform lacks the nuclear exporting signal (NES) domain located in the N-terminus. Given the role of ERK5 in regulating apoptosis in response to extracellular stimuli, I have also investigated the proapoptotic activity of ΔN-ERK5 compared to FL-ERK5. Immunofluorescence analysis in transiently transfected Hek293 and HeLa cells showed a higher frequency of cleaved Caspase-3 in ΔN-ERK5 overexpressing cells, suggesting a proapoptotic function of ΔN-ERK5. Remarkably, altered expression of ΔN-ERK5 was observed in urothelial bladder carcinoma (UBC) patients as well as and UBC cell lines. Collectively, my results suggest the potential clinical relevance of targeting ERK5 splicing for anti-cancer treatment.

Identificazione e caratterizzazione funzionale di una nuova isoforma di splicing alternativo di ERK5. Lo splicing alternativo (AS) è il processo post-trascrizionale che produce diversi trascritti a partire da un singolo gene. Questo comporta l’espressione di una varietà di proteine con differenti funzioni, strutture, localizzazioni cellulari e stabilità. La regolazione da parte di AS rappresenta uno dei meccanismi principali per espandere il potenziale codificante del genoma umano. Sebbene AS sia importante per modulare molti processi biologici durante lo sviluppo, la sua alterazione contribuisce direttamente alla progressione del cancro e alla resistenza terapeutica. Le chinasi eucariotiche sono proteine fondamentali che partecipano in molti processi cellulari e sono altamente regolate da AS. Tra le varie chinasi, le Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) controllano le cascate di segnali che mediano le risposte cellulari a diversi stimoli (tra cui fattori di crescita e stress chimici o osmotici). Extracellular-signal Regulated Kinase 5 (ERK5) è l’ultimo membro scoperto di questa famiglia e, diversamente dagli altri membri, contiene un dominio di trans attivazione (TAD) distintivo che gli permette di attivare direttamente i fattori di trascrizione in risposta a diversi stimoli. ERK5 regola la proliferazione cellulare, l’apoptosi, il differenziamento e la sopravvivenza cellulare. Curiosamente, un’anomala attività di ERK5 è stata osservata nella progressione di molti tipi di tumore, come nel cancro della vescica, del seno, della prostata o nel cancro colorettale. Più precisamente, un’attività anomala di ERK5 è stata connessa all’attivazione di molti tratti distintivi del cancro, dalla sostenuta proliferazione alla resistenza e alla morte cellulare. Il mio progetto di tesi si è focalizzato sull’identificazione di un nuovo trascritto del gene umano ERK5, derivante da splicing alternativo. Questa variante, annotata in molti databases pubblici, è generata dall’esclusione dell’esone 2 e 3 dall’mRNA maturo di ERK5. Data la conseguente perdita di una porzione del dominio N-terminale, abbiamo chiamato la variante ΔN-ERK5. Per caratterizzare il ruolo biologico di ΔN-ERK5, ho clonato in un vettore di espressione per cellule di mammifero il cDNA codificante per questa proteina e per l’isoforma canonica (FL-ERK5), fusi con il tag FLAG. In seguito alla loro trasfezione in cellule Hek293 e HeLa, ne ho valutato la localizzazione utilizzando la tecnica dell’immunofluorescenza e microscopia confocale. Questo mi ha permesso di dimostrare che le isoforme proteiche di ERK5 sono caratterizzate da differente localizzazione, con FL-ERK5 rilevata unicamente nel citoplasma mentre ΔN-ERK5 localizzata sia nel nucleo che nel citoplasma. Questo risultato è in accordo con l’osservazione che l’isoforma ΔN-ERK5 è priva del segnale di esporto nucleare (NES) localizzato nella regione N-terminale. Dato il ruolo di ERK5 nel regolare l’apoptosi in risposta a stimoli extracellulari, ho anche investigato l’attività pro-apoptotica di ΔN-ERK5 rispetto alla proteina FL-ERK5. Le analisi tramite immunofluorescenza in cellule Hek293 e HeLa trasfettate in modo transiente hanno mostrato un’espressione maggiore di Caspase-3 attivata nelle cellule overesprimenti ΔN-ERK5, a suggerire una attivazione del processo apoptotico in tali cellule. Di nota, un’espressione alterata di ΔN-ERK5 è stata osservata in pazienti affetti da carcinoma della vescica uroteliale (UCB) e in linee cellulari di UCB. Complessivamente, i miei risultati indicano la potenziale rilevanza clinica del targeting dello splicing di ERK5 come terapia contro il cancro.