Production, purification and crystallization of an anti-phenyl-oxazolone antibody Fab fragment

Affinity maturation of antibodies is mainly a genetic process based on mutations in the germline sequences that code for the VH and VL variable regions. These modifications, typically located in the complementarity determining region (CDR) mediating antigen-binding, directly influence the corresponding structure and therefore also the binding specificity for a certain antigen. Of these changes, only those that improve the relative affinity to the antigen are then maintained, thanks to an antigen-based selection process. This thesis is part of a wider project which aims to study the structural variations of ten antibodies belonging to three different classes, generated from the response to the hapten 2-phenyl-5-oxazolone (phOx). The purpose is to shed some light on the structural factors responsible for the association and dissociation rate variations, and in general of the affinity modifications, related to the binding between the antigen and the antibody. Specifically, this thesis is focused on the production optimization of the Fab fragment of the high-affinity class I NQ19/22.21 anti-phOx antibody, with the final aim of crystallizing it in complex with the hapten phOx in order to study its structure by X-ray diffraction. Previous studies, carried out in our lab, successfully improved the production of this specific antibody through the use of a variant sequence carrying a single Arginine residue from the V-Ckappa junction of the light chain instead of two. These studies set the stage for our experiments, aimed to improve the expression of this Fab fragment in the HEK 293T cell line, both at a small and large scale, and to allow the chromatographic purification step required for the subsequent crystallization process.

Il fenomeno di maturazione dell’affinità anticorpale è un processo genetico, basato su mutazioni nelle sequenze della linea germinale codificanti per le regioni variabili VH e VL dell’anticorpo. Queste modificazioni, localizzate prevalentemente nelle complementarity determining region (CDR), cioè le regioni deputate al legame con l’antigene, influenzano direttamente la corrispondente struttura e di conseguenza determinano l’affinità per lo specifico antigene. Di queste modifiche, solo quelle che hanno l’effetto di migliorare l’affinità dell’anticorpo verso l’antigene verranno poi mantenute grazie a un processo di selezione basato sull’antigene. Questa tesi si inserisce in un progetto più ampio, che ha come scopo quello di studiare queste variazioni strutturali in dieci diversi anticorpi (appartenenti a tre diverse classi), che fanno parte del processo di maturazione nel sistema sperimentale del 2-fenil-ossazolone (phOx). In questo modo, si vuole cercare di far luce sui fattori strutturali responsabili della variazione della velocità di associazione e di dissociazione del legame antigene-anticorpo e, in generale, della sua affinità. Più specificatamente, in questa tesi ci si è focalizzati sul miglioramento del processo di produzione e purificazione del frammento Fab anti-phOx dell’anticorpo di classe I NQ19/22.21 (ad alta affinità), con lo scopo di permetterne la cristallizzazione in complesso con il phOx ed il conseguente studio strutturale basato sulla diffrazione a raggi X. Precedenti studi condotti nel nostro laboratorio sono riusciti a migliorare i livelli di produzione di questo specifico anticorpo tramite l’utilizzo di una variante comprendente un solo residuo di Arginina nella giunzione V-Ckappa sulla catena leggera, anziché due. Questi studi hanno posto le basi per gli esperimenti qui descritti, mirati a migliorare sia il livello di espressione del frammento Fab in cellule umane HEK 293T, in piccola e in larga scala, sia il successivo processo di purificazione cromatografico, a cui è seguita poi la fase di cristallizzazione.