Characterization of the lipase LipA as antigen candidate to develop a vaccine against Burkholderia cenocepacia.

Cystic Fibrosis (CF) is the most prevalent autosomal recessive disease that can lead to long-suffering multi-organ failure, and recurring or chronic respiratory infections. The disease leads to increase of sodium and chloride concentration in sweat, and exocrine pancreatic insufficiency. The mucociliary dysfunction is caused by reduced hydration of the airway surface liquid, and failure to clear mucus leads to mucus accumulation. The CF involved gene encodes a transmembrane protein that is a functional chloride (Cl-) channel called CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) which is an ATP-binding cassette (ABC) transporter, and has a role in the secretion of the electrolytes and fluids in the pancreas, intestine, and sweat gland secretory coil, and in the absorption of the fluids and electrolytes in the airway epithelial cells and sweat gland duct. CF patients can develop chronic lung infection due to common respiratory pathogens such as Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Burkholderia cepacia complex bacteria (Bcc). Bcc has been identified as an opportunistic pathogen group with 22 different members that cause severe disease in immunocompromised patients such as CF patients. The B. cepacia complex can cause long-lasting respiratory infection in CF airways, due to the CFTR mutation causing mucus layer thickening and this environment is ideal for microbial colonization. The aim of this thesis is to characterize the role of the exported lipase BCAM0949 (LipA) as possible antigen candidate, constructing a markerless deletion mutant of B. cenocepacia K56-2. The B. cenocepacia ΔBCAM0949 was successfully constructed using a suicide vector and triparental mating. The mutant was evaluated for its growth in Luria-Bertani (LB) and Artificial Sputum Medium (ASM) and for its antibiotic resistance against a panel of 10 compounds and compered with the WT B. cenocepacia K56-2. Growth curves in 2 different media (LB and ASM) were used for the comparison of the mutant and the WT. To understand involvement of BCAM0949 in virulence, biofilm formation assay and swimming motility assay were performed both in LB and ASM, and the results were compered to WT B. cenocepacia K56-2. The results of the experiments done in the thesis showed that the deletion of BCAM0949 does not affect bacterial grow in the tested conditions. Antibiotic susceptibility of the two strains showed that deletion of BCAM0949 correlates with a diminished resistance to piperacillin. Biofilm formation assay results demonstrated that B. cenocepacia ΔBCAM0949 produced a lower quantity of biofilm compared to B. cenocepacia K56-2, and the results suggested that the deletion has a role in the biofilm formation, therefore further investigation would be necessary to understand the role of this lipase in the biofilm pathway. The swimming motility assay results showed that there is a significant difference between B. cenocepacia K56-2 and B. cenocepacia ΔBCAM0949, and the deletion leads the strain to be impaired in swimming motility. This result suggests that the lipase BCAM0949 has a role in the flagellar motility and further investigation would help to understand this connection. The experiments done in this thesis highlighted the role of the lipase BCAM0949 in the biofilm formation and swimming motility, and further research to understand its value as putative antigen candidate will include the killing assay in Galleria mellonella which can be selected as an animal model.

Caratterizzazione della lipasi LipA come candidato antigene per lo sviluppo di un vaccino contro Burkholderia cenocepacia. La fibrosi cistica (FC) è la malattia autosomica recessiva più diffusa che può portare a insufficienza multiorgano di lunga durata e infezioni respiratorie ricorrenti o croniche. La disfunzione mucociliare è causata dalla ridotta idratazione del liquido superficiale delle vie aeree e la mancata rimozione del muco porta ad un accumulo. Il gene coinvolto nella FC codifica una proteina transmembrana che è un canale funzionale del cloro (Cl-) chiamato CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), che è un trasportatore ATP-binding cassette (ABC) e ha un ruolo nella secrezione di elettroliti e fluidi nel pancreas, nell'intestino e nelle ghiandole sudoripare e nell'assorbimento dei liquidi e degli elettroliti nelle cellule epiteliali delle vie aeree. I pazienti con FC possono sviluppare infezioni polmonari croniche dovute a patogeni respiratori comuni come Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, batteri appartenenti al Burkholderia cepacia complex (Bcc). Il Bcc è stato identificato come un gruppo di patogeni opportunisti con 22 diversi membri che causano malattie gravi in pazienti immunocompromessi come i pazienti con FC. I membri del Bcc sono batteri Gram-negativi aerobi, non sporigeni, produttori di catalasi e non fermentanti il lattosio. Il Bcc può causare infezioni respiratorie di lunga durata nelle vie aeree FC, a causa della mutazione CFTR che causa l'ispessimento dello strato di muco e questo ambiente è ideale per la colonizzazione microbica. Lo scopo di questa tesi è di caratterizzare il ruolo della lipasi secreta BCAM0949 (LipA) come possibile candidato antigene, costruendo un mutante di delezione di B. cenocepacia K56-2. B. cenocepacia ΔBCAM0949 è stato costruito con successo utilizzando un vettore suicida e il triparental mating. Il mutante è stato valutato per la sua crescita in Luria-Bertani (LB) e Artificial Sputum Medium (ASM) e per la sua resistenza agli antibiotici contro un pannello di 10 composti e confrontato con il ceppo WT B. cenocepacia K56-2. Le curve di crescita in 2 diversi terreni (LB e ASM) sono state utilizzate per il confronto del mutante e del WT. Per comprendere il coinvolgimento di BCAM0949 nella virulenza, il test di formazione del biofilm e il test di motilità sono stati eseguiti sia in LB che in ASM e i risultati sono stati confrontati con il ceppo WT B. cenocepacia K56-2. I risultati degli esperimenti condotti nella tesi hanno mostrato che la delezione di BCAM0949 non influisce sulla crescita batterica nelle condizioni testate. La suscettibilità agli antibiotici dei due ceppi ha mostrato che la delezione di BCAM0949 è correlata a una ridotta resistenza alla piperacillina. I risultati del test di formazione del biofilm hanno dimostrato che B. cenocepacia ΔBCAM0949 produce una quantità inferiore di biofilm rispetto a B. cenocepacia K56-2, pertanto sarebbero necessarie ulteriori indagini per comprendere il ruolo di questa lipasi nella formazione del biofilm. I risultati del test della motilità hanno mostrato che esiste una differenza significativa tra B. cenocepacia K56-2 e B. cenocepacia ΔBCAM0949 e la delezione porta ad una alterazione nella motilità. Questo risultato suggerisce che la lipasi BCAM0949 abbia un ruolo nella motilità flagellare e ulteriori indagini aiuterebbero a capire questa connessione. Gli esperimenti condotti in questa tesi hanno evidenziato il ruolo della lipasi BCAM0949 nella formazione del biofilm e nella motilità e ulteriori ricerche per comprendere il suo valore come candidato antigene putativo includeranno test in Galleria mellonella come modello animale.