The spatiotemporal organization of intracellular space is crucial for many cellular processes. For instance, the precise localization of biomolecules allows complex reactions to occur, and this is possible thanks to precise molecular mechanisms that ensure the compartmentalization of the cellular milieu. Although most known compartments like nucleus and mitochondria have a lipid bounding membrane, in recent years it became obvious that cells can contain functional macromolecule assemblies that remain distinct without a lipid membrane and are called Membranelles organelles (MLOs). Membranelles organelles are dynamic structures formed by the transient protein-protein and / or protein-nucleic acid interactions. The formation of MLOs is a multiparametric process, however in recent years, the process of liquid-liquid phase separation (LLPS) it is thought to play a major role. The ability of a protein to undergo LLPS has been strictly connected to specific regions characterized by low complexity (low complexity regions or intrinsically disordered regions (IDRs)). In the present thesis we developed a multiparametric work flow aiming to identify proteins with the theoretical potential to form biomolecular condensates. In the first part, we used a multiengine in silico search for “weighting” the probability of human proteins to undergo LLPS and therefore participate in MLOs formation. Our bioinformatic analysis availed of six published LLPS predictor algorithms that each evaluated different biophysical and biochemical characteristics of each protein. Once a list of putative targets was produced, we performed designed an immunofluorescence assay that allowed to perform a first screening. This assay was based on the use of 1,6 hexanediol (1,6-HD), a compound known to dissipate MLOs. Our immunofluorescence screening revealed that two proteins, GPBP1 and DACH1 were able to form dynamic structures that were 1,6-HD sensitive (both dissolved in response to treatment with 5% 1,6-HD). Overall, we present a comprehensive and unbiased workflow that allows the identification of proteins able to form or participate in the formation of membranelles organelles.
Un'analisi polimetrica del proteoma umano per proteine con potenziale di biocondensabilità. L'organizzazione spazio-temporale dello spazio intracellulare è cruciale per molti processi cellulari. Ad esempio, la precisa localizzazione delle biomolecole consente il verificarsi di reazioni complesse, e questo è possibile grazie a precisi meccanismi molecolari che assicurano la compartimentazione dell'ambiente cellulare. Sebbene la maggior parte dei compartimenti noti come il nucleo e i mitocondri abbiano una membrana lipidica, negli ultimi anni è stato scoperto che le cellule possono contenere gruppi di macromolecole funzionali che non necessitano una membrana lipidica e sono chiamati organelli senza membrane (Membraneless Organelles; MLOs), biocondensati, oppure condensati biomolecolari. Gli MLOs sono strutture dinamiche formate dalle interazioni transitorie interproteiche (proteina-proteina) e/o proteina-acido nucleico. La formazione di MLOs è un processo multi-parametrico, tuttavia è ben noto che il processo di separazione di fase (Liquid-Liquid Phase Separation; LLPS) svolga un ruolo importante. La capacità di una proteina di subire LLPS è stata strettamente collegata a regioni specifiche caratterizzate da bassa complessità (regioni a bassa complessità o regioni intrinsecamente disordinate; IDRs). Nella presente tesi abbiamo sviluppato un approccio multiparametrico con l'obiettivo di identificare proteine con il potenziale teorico di formare condensati biomolecolari. Nella prima parte, abbiamo utilizzato una ricerca multimotore in silico per valutare la probabilità delle proteine umane di subire LLPS e quindi partecipare alla formazione di MLOs. La nostra analisi bioinformatica si è avvalsa di sei algoritmi predittori di LLPS disponibili in letteratura, ciascuno dei quali ha valutato diverse caratteristiche biofisiche e biochimiche di ciascuna proteina. Una volta prodotto un elenco di presunti bersagli, abbiamo sviluppato un saggio di immunofluorescenza che ha consentito di eseguire un primo screening. Questo test è basato sull'utilizzo di 1,6-esandiolo (1,6-HD), un composto noto per la sua capacità di dissipare gli MLOs. Il nostro screening ha rivelato che due proteine, GPBP1 e DACH1, sono in grado di formare strutture dinamiche sensibili all'1,6-HD (entrambe disciolte in risposta al trattamento con 5% di 1,6-HD) che probabilmente sono condensati. Nel complesso, presentiamo un approccio comprensivo e imparziale che consente l'identificazione di proteine in grado di formare o partecipare alla formazione di organelli privi di membrana.
Un'analisi polimetrica del proteoma umano per proteine con potenziale di biocondensabilità
BAYBURTLU, DORUK KAAN
2021/2022
Abstract
The spatiotemporal organization of intracellular space is crucial for many cellular processes. For instance, the precise localization of biomolecules allows complex reactions to occur, and this is possible thanks to precise molecular mechanisms that ensure the compartmentalization of the cellular milieu. Although most known compartments like nucleus and mitochondria have a lipid bounding membrane, in recent years it became obvious that cells can contain functional macromolecule assemblies that remain distinct without a lipid membrane and are called Membranelles organelles (MLOs). Membranelles organelles are dynamic structures formed by the transient protein-protein and / or protein-nucleic acid interactions. The formation of MLOs is a multiparametric process, however in recent years, the process of liquid-liquid phase separation (LLPS) it is thought to play a major role. The ability of a protein to undergo LLPS has been strictly connected to specific regions characterized by low complexity (low complexity regions or intrinsically disordered regions (IDRs)). In the present thesis we developed a multiparametric work flow aiming to identify proteins with the theoretical potential to form biomolecular condensates. In the first part, we used a multiengine in silico search for “weighting” the probability of human proteins to undergo LLPS and therefore participate in MLOs formation. Our bioinformatic analysis availed of six published LLPS predictor algorithms that each evaluated different biophysical and biochemical characteristics of each protein. Once a list of putative targets was produced, we performed designed an immunofluorescence assay that allowed to perform a first screening. This assay was based on the use of 1,6 hexanediol (1,6-HD), a compound known to dissipate MLOs. Our immunofluorescence screening revealed that two proteins, GPBP1 and DACH1 were able to form dynamic structures that were 1,6-HD sensitive (both dissolved in response to treatment with 5% 1,6-HD). Overall, we present a comprehensive and unbiased workflow that allows the identification of proteins able to form or participate in the formation of membranelles organelles.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/15175