Alterazioni delle giunzioni cellulari in osteoblasti di un modello murino di osteogenesi imperfetta di tipo XIV

Osteogenesis imperfecta (OI) or brittle bone disease is a group of rare collagenopathies characterized by reduced bone mass and bone fragility. Mutations in the TMEM38B gene, which encodes for the trimeric intracellular cation channel B (TRIC-B) an ER channel specific for K+ ions that is essential for modulating intracellular Ca2+ signalling, result in a rare form of autosomal recessive OI type XIV. The absence of TRIC-B has been associated with matrix insufficiency and alterations in Ca2+-dependent proteins involved in collagen folding and post-translational modifications, although it remains unclear how TRIC-B mutations affect osteoblasts (OBs), the bone making cells, and cause the disease. To dissect the TRIC-B function specifically in OBs, a conditional OB knock-out murine model (Runx2Cre;Tmem38bfl/fl, cKO) was generated in our laboratory. During my internship we found that TRIC-B deficiency affects both differentiation and mineralization of primary murine OBs. Since cell-cell and cell-matrix interactions play essential roles in regulating OB activity and bone homeostasis, we evaluated the effect of lack of TRIC-B on cell junctions. Altered cell junctions and cytoskeletal organization were found by morphological and immunofluorescence analyses in TRIC-B cKO OBs. In particular, an impaired cell-cell cadherin junctions complex was found since reduced expression of ZO-1, a cadherin-based adhesion junction-associated protein, was detected. Since β-catenin is a key player in the WNT signaling promoting osteoblastogenesis and it connects several cadherins to the cytoskeleton, β-catenin analysis was performed. Immunofluorescent imaging showed an accumulation of β-catenin at the cell junction sites. Alterations were also found at the level of the gap junctions: the connexin 43 was strongly decreased both at mRNA and protein level in cKO OBs during mineralization. Lastly, cell-matrix focal adhesion junctions were examined. The analyses of phospho-focal adhesion kinase (pFAK) showed no differences in the pFAK amount but an higher number and shorter pFAKs fragments were visible in cKO OBs. All together our data reveal an impaired cell-cell and cell-matrix connection and an altered distribution of the WNT signaling main player β-catenin, likely contributing to the OBs defects in the TRIC-B cKO mice.

L'osteogenesi imperfetta (OI) o malattia delle ossa fragili è un gruppo di rare collagenopatie caratterizzate da una ridotta massa ossea e fragilità ossea. Mutazioni nel gene TMEM38B, che codifica per il canale cationico intracellulare trimerico B (TRIC-B), un canale ER specifico per gli ioni K+, essenziale per modulare la segnalazione del Ca2+-intracellulare, determinano la rara forma di OI autosomica recessiva di tipo XIV. L'assenza di TRIC-B è stata associata a un'insufficienza della matrice e ad alterazioni delle proteine Ca2+-dipendenti coinvolte nel ripiegamento del collagene e nelle modifiche post-traduzionali, anche se non è ancora chiaro come le mutazioni di TRIC-B influenzino gli osteoblasti (OB), le cellule che producono l'osso, e causino la malattia. Per analizzare la funzione di TRIC-B in modo specifico negli OBs, nel nostro laboratorio è stato generato un modello murino knock-out condizionale negli osteoblasti (Runx2Cre;Tmem38 fl/fl, cKO). Durante il mio tirocinio abbiamo scoperto che la carenza di TRIC-B influisce sia sulla differenziazione che sulla mineralizzazione degli OB primari murini. Poiché le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice svolgono ruoli essenziali nella regolazione dell'attività degli OB e dell'omeostasi ossea, abbiamo valutato l'effetto della mancanza di TRIC-B sulle giunzioni cellulari. Analisi morfologiche e di immunofluorescenza hanno evidenziato un'alterazione delle giunzioni cellulari e dell'organizzazione citoscheletrica negli OB TRIC-B cKO. In particolare, è stata riscontrata un'alterazione del complesso giunzionale delle caderine, poiché è stata rilevata una ridotta espressione di ZO-1, una proteina associata alla giunzione di adesione basata sulle caderine. Poiché la β-catenina è un attore chiave nella segnalazione WNT che promuove l'osteoblastogenesi e collega diverse caderine al citoscheletro, è stata eseguita un'analisi della β-catenina. L'imaging in immunofluorescenza ha mostrato un accumulo di β-catenina nei siti di giunzione cellulare. Sono state riscontrate alterazioni anche a livello delle giunzioni gap: la connessina 43 era fortemente diminuita sia a livello di mRNA che di proteine negli OBs cKO durante la mineralizzazione. Infine, sono state esaminate le giunzioni di adesione focale cellula-matrice. Le analisi della forma fosforilata della chinasi di adesione focale (pFAK) non hanno mostrato differenze nella quantità di pFAK, ma un numero maggiore e frammenti più corti di pFAK erano visibili negli OBs cKO. Nel complesso, i nostri dati rivelano un'alterata connessione cellula-cellula e cellula-matrice e una distribuzione alterata del principale attore della segnalazione WNT, la β-catenina, che probabilmente contribuisce ai difetti degli OB nei topi TRIC-B cKO.