Utilizzo della linea cellulare SH-SH5Y per testare in via preliminare la biocompatibilità di un innovativo fotomoltiplicatore al silicio (SiPM) impiegato per sviluppare una nuova generazione di impianto subretinico avanzato.

Several retinal retinopathies, such as Retinitis Pigmentosa (RP) and Age-related Macular Degeneration (AMD), are characterized by progressive vision loss, due to the death of photoreceptors. In general, retinal degenerative diseases do not cause damage to the inner layers of the retina, leaving both bipolar and ganglion cells intact. Since these pathologies currently have no cure, retinal prostheses seem promising because they can replace the phototransduction of cones and rods and exploit the physiological transmission of visual signals toward the cortex. The SPEye project aims to develop an innovative subretinal prosthesis consisting of a silicon photomultiplier (SiPM). This device should provide a better spatial resolution than currently available prostheses, due to its high density of photodiodes. The matrix of photosensors is able to detect photons and generate intense localized electric field variation without high energy consumption. During this work, once the field potential generated by the activation of the SiPM has been quantified, the biocompatibility of the photomultiplier and its functioning in biological conditions have been assayed. For this purpose, in this work, two differentiation protocols were devised to obtain the best neuronal phenotype from the SH-SY5Y neuroblastoma cell line. These cells were plated and cultured directly on the surface of the SiPM to mimic the functioning of the retinal bipolar cells. Unfortunately, despite several attempts, in our preliminary experiments, the resin employed to cover the photodiodes proved to be unsuitable for promoting SH-SY5Y cell growth. For this reason, waiting to test other types of more biocompatible resin, SH-SY5Y cells were transfected with ChannelRhodopsin2, a light-gated Na+ channel that induces depolarization once activated by an appropriate optical stimulus. In this way, it has been possible to test the excitability of the SH-SY5Y cells using optogenetic stimulation. In addition, a pilot intracellular calcium recording was performed on undifferentiated SH-SY5Y cells to ascertain that they were able to internalize the FLUO-4 AM dye, a fluorescent Ca2+ chosen to perform future calcium imaging experiments on cells cultured on the SiPM. Moreover, during the project, we also tried to learn the surgical technique for the dissection of the mouse retina in order to be able to obtain primary retinal cultures, which better mimic the functioning of the retina in vivo and on which we intend to continue the stimulation experiments based on the SiPM.

Alcune retinopatie retiniche, come la Retinite Pigmentosa (RP) e la Degenerazione Maculare Legata all'Età (AMD), sono caratterizzate da una progressiva perdita della vista, dovuta alla morte dei fotorecettori. Generalmente, le malattie degenerative della retina non causano danni agli strati interni, lasciando intatte sia le cellule bipolari che quelle gangliari. Dato che queste patologie attualmente non hanno cura, le protesi retiniche sembrano essere promettenti perché possono sostituire la fototrasduzione operata dei coni e dei bastoncelli e sfruttare la trasmissione fisiologica dei segnali visivi verso la corteccia. Il progetto SPEye mira a sviluppare una protesi subretinica innovativa costituita da un fotomoltiplicatore al silicio (SiPM). Questo dispositivo dovrebbe fornire una migliore risoluzione spaziale rispetto alle protesi attualmente disponibili, grazie alla sua elevata densità di fotodiodi. La matrice di fotosensori è in grado di rilevare i fotoni e generare intense variazioni di campo elettrico localizzato senza elevati consumi energetici. Una volta quantificato il potenziale di campo generato dall'attivazione del SiPM, sono stati testati la biocompatibilità del fotomoltiplicatore e il suo funzionamento in condizioni biologiche. A tal fine, in questo lavoro, sono stati elaborati due protocolli di differenziamento per ottenere il migliore fenotipo neuronale dalla linea di neuroblastoma SH-SY5Y. Successivamente, queste cellule sono state piastrate e coltivate direttamente sulla superficie del SiPM per simulare le cellule bipolari. Tuttavia, la resina impiegata per ricoprire il SiPM non si è dimostrata adatta per la crescita delle cellule SH-SY5Y. Per questo motivo, in attesa di testare altri tipi di resina maggiormente biocompatibile, le cellule SHSY5Y sono state trasfettate con ChannelRhodopsin2, un canale del Na+ attivato dalla luce che induce depolarizzazione una volta attivato da un opportuno stimolo ottico. In questo modo è stato possibile testare l’eccitabilità delle cellule SH-SY5Y utilizzando una stimolazione optogenetica. Inoltre, è stata effettuata una registrazione pilota del calcio intracellulare su cellule SH-SY5Y non differenziate per accertarsi che fossero in grado di internalizzare il colorante FLUO-4 AM, scelto per condurre futuri esperimenti di imaging del calcio su cellule coltivate sul SiPM. Inoltre, durante il progetto si è anche cercato di apprendere la tecnica chirurgica per la dissezione della retina di topo al fine di poter ottenere colture retiniche primarie, che mimano meglio il funzionamento della retina in vivo e sulle quali si intende proseguire gli esperimenti di stimolazione sul SiPM.