Exploring TDP1α and TDP1β function in a panel of Arabidopsis thaliana DDR mutants

DNA Damage Response (DDR) is a complex signal transduction network required for preserving genome integrity. DDR pathway is triggered by a wide variety of endogenous and exogenous factors such as errors introduced during DNA replication, DNA strand breaks, reactive oxygen species (ROS), ultraviolet light and chemical agents. Various studies showed that DDR signalling cascade is well conserved between plants and animals even if this pathway is much more studied in humans than in plants, where DDR pathway is still not very clear. Both in mammals and in plants, DDR activation relies on ATM and ATR, two protein kinases that activate the downstream components responding to double-strand (DSBs) and single-strand breaks (SSBs). While in animals ATM and ATR activation converge to the activation of p53, in plants it hypothesized that they can activate two different pathways, one SOG1-dependent pathway and a SOG1-independent pathway, which rely on E2FB. DNA repair pathways downstream DDR include the Tyrosil-DNA phosphodiesterase1 (TDP1) enzyme that hydrolyses the phosphodiester bond between tyrosine of topoisomerase I (TopI) and 3’-phosphate of DNA and hence repairs the TopI-DNA covalent bonds. A small TDP1 subfamily, composed of TDP1α and TDP1β has been identified in plants. While TDP1α was demonstrated to be involved in DNA repair and maintenance of genome integrity, the function of TDP1β are still unknown. The aim of the present thesis is to investigate the role of the two TDP1 genes in relation to DDR. To do so, this study exploited a series of Arabidopsis thaliana DDR single and double mutants defective for sog1, e2fb, pol2A, atm and atr genes. Phenotypic and molecular analyses (e.g., DNA damage evaluation, gene expression profiles) were performed on non-treated and treated Arabidopsis thaliana DDR mutants with genotoxic agents Camptothecin (CPT, inhibitor of TopI) and NSC120686 (inhibitor of hTDP1). The results indicate that while TDP1α gene is involved in the repair of DBBs and SSBs, TDP1β function is related to replication stress.

Studio sulla funzione dei geni TDP1α e TDP1β in una collezione di mutanti DDR di Arabidopsis thaliana. La risposta al danno al DNA (DDR) comprende una rete complessa di trasduzione di segnali necessaria per mantenere l’integrità del genoma di un organismo. Questo meccanismo è influenzato da diversi fattori esogeni ed endogeni come errori introdotti durante la replicazione del DNA, formazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), luce ultravioletta e agenti chimici. Diversi studi hanno dimostrato che la cascata del segnale della DDR è conservata negli animali e nelle piante anche se questo meccanismo risulta molto più studiato negli umani che nelle piante, dove il meccanismo della DDR non è ancora chiaro. Sia nei mammiferi che nelle piante, l’attivazione del DDR si basa sulla funzione di due proteine chinasi, ATM e ATR, le quali attivano a loro volta i componenti a valle della cascata in risposta a rotture a doppio filamento (DSBs) o rotture a singolo filamento (SSBs). Negli animali l’attivazione di ATM e ATR porta all’attivazione di p53, mentre nelle piante vengono attivate due vie differenti, una SOG1 dipendente e una SOG1 indipendente, la quale si basa sull’attivazione del fattore E2FB. Le vie di riparazione del DNA a valle della DDR includono l’enzima tirosil-DNA fosfodiesterasi 1 (TDP1) la cui funzione è idrolizzare il legame fosfodiesterico tra la tirosina della Topoisomerasi I e il residuo 3’-fosfato della catena di DNA e riparare quindi il danno al DNA che può essere provocato dalla Topoisomerasi I. Nelle piante è stata identificata una piccola sottofamiglia genica TDP1, composta da TDP1α e TDP1β. Mentre è stato dimostrato che TDP1α è coinvolto nella riparazione del DNA e nel mantenimento dell'integrità del genoma, la funzione di TDP1β è ancora sconosciuta. Lo scopo della presente tesi è di indagare il ruolo dei due geni TDP1 in relazione al DDR. Per fare ciò, questo studio si e basato sul utilizzo di una serie di singoli e doppi mutanti DDR di Arabidopsis thaliana difettosi per i geni sog1, e2fb, pol2A, atm e atr. Sono state eseguite analisi fenotipiche e molecolari (ad esempio, valutazione del danno al DNA, profili di espressione genica) su mutanti DDR non trattati e trattati con agenti genotossici camptotecina (CPT, inibitore di TopI) e NSC120686 (inibitore di hTDP1). I risultati indicano che mentre il gene TDP1α è coinvolto nella riparazione di DBB e SSB, la funzione TDP1β è correlata allo stress di replicazione.