Usefulness of Whole-Exome Sequencing in the diagnostic work-up of pediatric cytopenias Utilizzo del sequenziamento dell’esoma nel percorso diagnostico delle citopenie pediatriche

Pediatric cytopenias are a heterogeneous group of conditions that can be inherited or acquired. Specifically, they occur due to bone marrow failure (BMF) characterized by either hypoplasia or hematopoietic stem cells (HSCs) dysfunction. Cytopenias can affect a single cell lineage (anemia, leukopenia, thrombocytopenia) or multiple cell lineages, with pancytopenia representing the extreme end of this condition. Cytopenia is frequently observed in patients with inherited bone marrow failure syndromes (IBMFS), such as Fanconi anemia (FA), Dyskeratosis congenita (DC), Diamond-Blackfan anemia (DBA), and Shwachman-Diamond syndrome (SDS). Phenotypic overlap and high clinical variability make differential diagnosis of these conditions extremely challenging. Different laboratory tests have been developed to help diagnostic work-up. For instance, the DEB (diepoxybutane) test has been considered for a long time the gold standard for FA diagnosis. However, DEB test has some limitations, such as the presence of somatic revertant mosaicism. The advent of Next Generation Sequencing (NGS) has certainly fostered the molecular diagnosis of cytopenias in the last few years. This thesis work aims to confirm the efficacy of Whole-Exome Sequencing (WES) in the molecular diagnosis of pediatric cytopenias with uncertain clinical picture and to compare its diagnostic yield to the conventional panel-based approach. Our cohort includes 21 pediatric patients with hematological manifestations compatible with cytopenias, of whom 9 with suspected FA but negative DEB testing. The WES approach, either trio (patient and parents) or singleton (proband only), allowed to identify a possible causative variant in 13/21 patients. These variants were divided into "diagnostic" and "candidate" based on ACMG (The American College of Medical Genetics and Genomics) classification, overlap with the patient's phenotype and coherence with the most likely inheritance model. In conclusion, among the 13 positive patients, WES molecularly confirmed FA in only 1/9 of the patients enrolled with this clinical suspicion (in agreement with DEB test findings), whereas the other patients were diagnosed with the following conditions: - Shwachman-Diamond syndrome - Diamond-Blackfan syndrome - LADD syndrome - Agammaglobulinemia 8B - Trichohepatoenteric syndrome (THES) - Congenital erythropoietic porphyria - Immune dysregulation (immunodeficiency) with autoimmunity Overall, WES reached a diagnostic yield of 62% in the general cohort but 86% among patients with a strict clinical suspicion of IBMFS. Importantly, WES allowed to suspect phenotypic expansions for two genes (FGFR2 and TCF3), also based on interactome tools (such as STRING), animal databases (such as MGI) and literature data. Finally, WES allowed identifying variants in genes that are not usually included in the most “popular” commercial panels, demonstrating the WES additional power compared to targeted sequencing in pediatric cytopenias.

Le citopenie pediatriche sono un gruppo eterogeneo di condizioni che possono essere ereditarie o acquisite. In particolare, si verificano a causa di una insuffficienza midollare (BMF) caratterizzata da ipoplasia o disfunzione delle cellule staminali ematopoietiche (HSCs). Le citopenie possono interessare una singola linea cellulare (anemia, leucopenia, trombocitopenia) o più linee cellulari, fino ad arrivare ad una condizione estrema di pancitopenia. La citopenia è frequentemente osservata in pazienti con sindromi da insufficienza midollare ereditaria (IBMFS), come l'anemia di Fanconi (FA), la Discheratosi congenita (DC), l'anemia di Diamond-Blackfan (DBA) e la sindrome di Shwachman-Diamond (SDS). La sovrapposizione fenotipica e l'elevata variabilità clinica rendono la diagnosi differenziale di queste condizioni estremamente complessa. Sono stati sviluppati diversi test di laboratorio per aiutare il work-up diagnostico. Per esempio, il test DEB (diepossibutano) è stato considerato per molto tempo il “gold standard” per la diagnosi di FA. Tuttavia, il DEB test presenta alcune limitazioni, come la presenza di mosaicismo somatico revertante. L'avvento delle tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha sicuramente favorito negli ultimi anni la diagnosi molecolare delle citopenie. Questo lavoro di tesi si propone di confermare l'efficacia del sequenziamento dell’esoma (Whole-Exome Sequencing - WES) nella diagnosi molecolare delle citopenie pediatriche con quadro clinico incerto e di confrontare la sua resa diagnostica rispetto all'approccio convenzionale basato sul pannello. La nostra coorte comprende 21 pazienti pediatrici con manifestazioni ematologiche compatibili con citopenie, di cui 9 con sospetta FA ma DEB test negativo. L'approccio WES, sia in trio (paziente e genitori) che in singolo (solo probando), ha permesso di identificare una possibile variante causativa in 13/21 pazienti. Queste varianti sono state suddivise in "diagnostiche" e "candidate" in base alla classificazione ACMG (“The American College of Medical Genetics and Genomics”), alla sovrapposizione con il fenotipo del paziente e alla coerenza con il modello ereditario più probabile. In conclusione, tra i 13 pazienti positivi, il WES ha confermato a livello molecolare la FA solo in 1/9 dei pazienti arruolati con questo sospetto clinico (in accordo con i risultati del DEB test), mentre agli altri pazienti sono state diagnosticate le seguenti condizioni: - Sindrome di Shwachman-Diamond - Sindrome di Diamond-Blackfan - Sindrome LADD - Agammaglobulinemia 8B - Sindrome tricoepatoenterica (THES) - Porfiria eritropoietica congenita - Disregolazione immunitaria (immunodeficienza) con autoimmunità Complessivamente, il WES ha raggiunto una resa diagnostica del 62% nella coorte generale, mentre dell'86% tra i pazienti con un forte sospetto clinico di IBMFS. È importante notare che il WES ha permesso di sospettare espansioni fenotipiche per due geni (FGFR2 e TCF3), anche mediante l’impiego di strumenti di interattomica (come STRING), database animali (come MGI) e dati di letteratura. Infine, il WES ha permesso di identificare varianti in geni che non sono solitamente inclusi nei pannelli commerciali più "popolari", confermando l’indubbio vantaggio del WES rispetto al sequenziamento mirato, ovvero basato sull’impiego di pannelli genici, nelle citopenie pediatriche.