ALTERAZIONI DELL'INNERVAZIONE SIMPATICA CARDIACA NELLA CARDIOMIOPATIA ARITMOGENA

Rationale and Purpose: Arrhythmogenic Cardiomyopathy (AC) is an incurable genetic cardiac disease, mainly associated to mutations in desmosomal genes, leading to stress-related arrhythmic sudden death, predominantly in young and athletes1–4. The AC myocardium features cardiomyocyte (CM) death and fibro-fatty lesions, which compromise heart contractility and generate the substrate for life-threating arrhythmias. AC research has focused on ‘desmosome-carrying’ CMs, but desmosomal proteins are expressed by several cell types, although not always organized into desmosomes5–9. Correlation between physical/emotional stress and arrhythmias incriminates sympathetic neurons (SNs), which may be the sought-after killers in disguise10–13. Thus, cardiac SNs (cSNs) are suspected to be additional cells affected in AC and participate to its pathogenesis. Methods: To test our novel hypothesis, we used Desmoglein-2 (Dsg2)mut/mut mice, harboring the AC-linked variant in Dsg2 at germline, as in humans. Mice were analyzed at 1 month (mo.) and 6 mo., corresponding to an early and advanced disease stage, respectively. cSN morphology and topology were analysed in murine hearts by IF, morphometric, molecular/biochemical analyses. Multiphoton imaging of clarified heart blocks delineated the SN network in the three-dimensions. IF and live imaging experiments were performed in vitro. Results: cSNs express desmosomal genes and proteins, and had dramatically altered morphology in AC mouse hearts. In detail, SN processes were thicker than controls, with irregularly distributed varicosities, which appeared hypertrophic. In addition, SN density was significantly increased in Dsg2mut/mut hearts. All of these alterations were evident already at 1 mo., when heart damage is still absent, and worsened during ageing, suggesting that abnormal cardiac innervation results from both the direct effect of AC mutations on SNs and damage-related factors. Consistently, at advanced disease stages, SN density was particularly high when close to the remodeled myocardial areas, as shown by 3D SN reconstruction, suggesting that cSNs may participate to myocardial remodeling. Notably, these findings replicated those of autoptic heart samples from DSG2 AC patients. The causal role of Dsg2 mutation in affecting cSNs was further confirmed by in vitro analyses, evidencing the same morphological alterations observed in vivo, accompanied by abnormal intracellular Ca2+ dynamics. In addition, molecular analyses demonstrated an aberrant production, by the AC myocardium, especially at advance AC stages, of trophic factors regulating the establishment and maintenance of cardiac innervation. Conclusions: Our results support the view of AC as a multicellular disease affecting the myocardial network, including cSNs, and that altered sympathetic innervation in AC hearts results from the combination of cell-autonomous and context-dependent factors.

Razionale e Ipotesi guida: La Cardiomiopatia Aritmogena (CA) è una malattia cardiaca su base genetica attualmente incurabile, associata, nella maggior parte dei casi con diagnosi genetica, a mutazioni nei geni desmosomiali. La CA è responsabile della gran parte dei casi di morte improvvisa dovuta ad aritmie, innescate da stress, nei giovani e negli atleti. Il miocardio dei pazienti affetti da CA è caratterizzato da morte progressiva dei cardiomiociti (CM) e da lesioni fibro-adipose, che compromettono la contrattilità del cuore e generano il substrato per aritmie potenzialmente fatali. Allo stato attuale, la ricerca sulla CA si è concentrata sui CM, cellule dotate di desmosomi, ma le proteine desmosomiali sono espresse dalla maggior parte dei tipi cellulari, cardiache ed extracardiache, anche se non sempre organizzate in desmosomi. La correlazione tra stress fisico/emotivo, la progressione della malattia ed incidenza di aritmie fatali, a portato ad ipotizzare che i neuroni simpatici (NS) che siano dei mediatori chiave nella patogenesi della malattia. Metodi: Per testare la nostra nuova ipotesi, abbiamo utilizzato come modello preclinico della malattia topi Dsg2mut/mut, portatori di una mutazione associata alla CA nel gene della Desmogleina-2 (Dsg2). Questi topi, che replicano la genetica umana e il fenotipo clinico, sono stati analizzati a 1 mese e a 6 mesi di età, corrispondenti rispettivamente a uno stadio precoce ed avanzato della malattia. La morfologia e la topologia dei NSc sono state analizzate nei cuori dei topi mediante immunofluorescenza (IF), analisi morfometriche, molecolari e biochimiche. L’imaging al microscopio multifotone di blocchi di tessuto cardiaco chiarificati ha permesso di delineare, nelle tre dimensioni, il network NS. Sono stati inoltre eseguiti esperimenti di IF e live imaging delle dinamiche del secondo messaggero Ca2+ in colture di NS. Risultati: In questo studio abbiam dimostrato che i NS esprimono i geni e le proteine desmosomiali e presentano una morfologia drammaticamente alterata nei cuori dei topi affetti da CA. Nel dettaglio, i processi neuronali sono più spessi, rispetto ai controlli, con varicosità ipertrofiche e distribuite in maniera irregolare. Inoltre, la densità dei NS è significativamente aumentata nei cuori Dsg2mut/mut. Tutte queste alterazioni sono evidenti già ad 1 mese, fase in cui il danno cardiaco è assente, e peggiorano con l'invecchiamento, suggerendo che l'anormale innervazione cardiaca derivi sia dall'effetto diretto sui NS, della mutazione in Dsg2, sia da fattori tissutali correlati al danno cardiaco. Coerentemente, negli stadi avanzati della malattia, la densità dei NS è risultata particolarmente elevata in prossimità delle aree miocardiche con sostituzione fibrosa, come mostrato dalle ricostruzioni 3D del network neuronale, suggerendo che i NSc, oltre ad innescare le aritmie, possano partecipare direttamente al rimodellamento miocardico. Di nota, questi risultati replicano quelli ottenuti precedentemente in campioni autoptici di cuori isolati da pazienti affetti da CA, dovuta a mutazione DSG2. Gli studi in vitro hanno dimostrato che la mutazione in Dsg2 influenza per se la morfologia dei NS e le dinamiche del Ca2+ intracellulare. In parallelo, analisi molecolari e biochimiche hanno rilevato un’alterazione nella produzione, da parte del miocardio CA nelle fasi avanzate di malattia, di fattori trofici che hanno un ruolo chiave nel mantenimento dell’innervazione cardiaca. Conclusioni: Complessivamente, i nostri risultati supportano la visione della CA come una malattia multicellulare che colpisce la rete miocardica, compresi i NSc, e che l'alterazione dell'innervazione simpatica, nei cuori affetti da CA, deriva dalla combinazione di fattori cell-autonomous e tessuto-dipendenti.