Valutazione dell’efficacia e della tossicità di microparticelle contenenti N-acetilcisteina su colture cellulari di cellule nasali tumorali RPMI 2650.

Questo elaborato di tesi consiste in uno studio approfondito sulla valutazione dell’efficacia e della tossicità delle MLC contenenti N-acetilcisteina su colture cellulari di cellule nasali tumorali RPMI 2650 provenienti da carcinoma a cellule squamose del setto nasale dal versamento pleurico di un uomo di 52 anni. Nell’ultimo decennio, dal punto di vista farmacologico, il naso offre intuitivamente un ambiente promettente per la somministrazione di farmaci. L’ampia superficie (150 cm2), la forte vascolarizzazione, l’elevato flusso sanguigno e l’alta permeabilità sono caratteristiche fondamentali della mucosa nasale che favoriscono un rapido assorbimento dei farmaci evitando il metabolismo epatico di primo passaggio. Inoltre, le cellule RPMI 2650 esprimono diverse citocheratine, producono muco e mostrano un'attività metabolica simile a quella della normale mucosa nasale umana. Pertanto, le cellule RPMI 2650 sono spesso utilizzate negli studi sul metabolismo dei farmaci. L’N-acetilcisteina è utilizzata come antiossidante, per andare a contrastare lo stress ossidativo che deriva dallo squilibrio tra la produzione di RONS e queste difese antiossidanti, ed è stata introdotta nella pratica clinica per il trattamento delle malattie polmonari e cardiovascolari, disturbi psichiatrici, malattie infettive, artrite reumatoide e iperlipoproteinemia plasmatica. Sono state, quindi, effettuate diverse analisi, quale l’MTT a 2H e a 24 H, per andare a testare la citotossicità dell’attivo attraverso la vitalità delle cellule. Quest’analisi è stata svolta, a diverse concentrazioni, per la NAC, NAC-CH-MLC e CH-MLC. Qualora la cellula trattata con una determinata concentrazione dell’attivo dovesse sopravvivere, allora l’enzima intracellulare, che prende il nome di deidrogenasi mitocondriale, determina la rottura dell’anello di tetrazolio dell’MTT, con conseguente formazione del derivato formazan, un sale che precipita sottoforma di cristalli di colorazione blu. In seguito, viene effettuata la lettura del campione attraverso un’analisi colorimetrica, a lunghezza d’onda 595 nm, andando così a valutare la differenza di reazione dovuta al colore. Per simulare la crescita del muco in vitro le cellule sono state seminate in degli inserti che presentano un filtro di PET, il quale simula la mucosa nasale, e sono state mantenute in coltura per 22 giorni. Durante la coltivazione sono state misurate e studiate la resistenza elettrica transepiteliale e la produzione di muco, mentre la permeabilità dei farmaci è stata valutata solo alla fine di questo periodo sperimentale. L’integrità dell’epitelio è stata controllata determinando la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) di ciascun inserto ogni 2-3 giorni. Nel corso di questi 22 giorni abbiamo effettuato l’Alcian Blue Test, un colorante cationico in grado di formare complessi insolubili con glicosaminoglicani acidi, consentendone così la determinazione quantitativa. Essendo un colorante cationico, ha permesso di andare a vedere la formazione del muco attraverso il legame con la mucina, proteina carica negativamente. Dunque, con queste analisi è stato possibile determinare che, grazie alla presenza del chitosano nelle MLC, l’N-acetilcisteina è in grado di penetrare le tight junction delle cellule epiteliali, potendo quindi esercitare la sua azione antiossidante e di prevenzione nei confronti delle specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto. In futuro, grazie al progredire di questi studi, sarà possibile sviluppare test farmacologici più sicuri e specifici per poter riuscire ad arrivare ad esercitare questi studi in vivo.