The centromere is the chromosome locus ensuring appropriate chromosome segregation during cell division, thus guaranteeing genome stability. The majority of eukaryotic centromeres include broad arrays of tandem repeats in their DNA sequence. Despite the necessity of maintaining centromere function, the centromeric DNA sequences of most species exhibited fast divergence, which means that they are not maintained across and within species. The "centromere paradox" is the name of the contradiction between function conservation and sequence divergence. The only centromeric protein that demonstrates clear specificity in binding a DNA sequence is CENP-B, which binds to a 17-bp conserved sequence known as the "CENP-B box" found inside the centromeric satellite DNA monomers of a number of species. Recent studies have confirmed the absence of CENP-B box sequences in centromeric satellite alpha DNA subfamilies. These results support the hypothesis that centromeric function is not dependent on the CENP-B protein-binding region. This study was performed under the supervision of Professor Elena Raimondi, Laboratory of Molecular Cytogenetics, University of Pavia and is part of a bigger research line carried out in conjunction with the Laboratory of Molecular and Cell Biology directed by Professor Elena Giulotto. The genus Equus is a distinctive model for examining the dynamics and processes underlying the development of centromeres. The centromere of chromosome 11 in Equus caballus is fully free of tandem repeats, according to the genome sequencing of this species. This finding led to the theory that centromere of chromosome 11 had just recently established throughout evolution, since it has not yet reached complete maturation by incorporating satellite DNA. This was the first instance of an evolutionary new centromere that was still immature. Many other satellite-free centromeres where thereafter discovered by our groups in equid species. Moreover, we demonstrated that a number of equid chromosomes are unable to bind the CENP-B protein even if they contain satellite DNA sequences. In light of these scientific arguments, this thesis work was focused on the comparison between the segregation fidelity of a horse chromosome (ECA 10) whose centromere contains satellite DNA and binds CENP-B with that of a chromosome (ECA 9) that has satellite DNA in its centromere but lacks the CENP-B box, preventing it from binding CENP-B. To do this, we used the interphase aneuploidy test. The frequency of aneuploidies carried by each of the chromosomes in issue was assessed in interphase nuclei by FISH analysis using distinct BAC probes, one unique to chromosome 9 and the other to chromosome 10. The results obtained demonstrated that the mitotic stability of the two chromosomes was comparable, as confirmed by statistical analysis. We also set up the CBMN assay under control and mitotic stress conditions. This test should have been coupled to FISH, using the same probes used for the interphase analysis, in order to compare the stability of the chromosomes under study and confirm the previously obtained results. Regrettably, the results of FISH on micronuclei were inconclusive. In conclusion, while preliminary, the present results strongly support the hypothesis that chromosome segregation can correctly occur even if the CENP-B protein is not bound to the centromere.
Il ruolo ruolo di CENP-B nella forza centromerica. Il centromero è il locus cromosomico che assicura un'appropriata segregazione dei cromosomi durante la divisione cellulare, garantendo così la stabilità del genoma. La maggior parte dei centromeri eucariotici include ampie matrici di ripetizioni in tandem nella propria sequenza di DNA. Nonostante la necessità di mantenere la funzione del centromero, le sequenze di DNA centromerico della maggior parte delle specie hanno mostrato una rapida divergenza, il che significa che non si mantengono tra le specie e all'interno di esse. Il "paradosso del centromero" è il nome della contraddizione tra conservazione della funzione e divergenza della sequenza. L'unica proteina centromerica che dimostra una chiara specificità nel legare una sequenza di DNA è CENP-B, che si lega a una sequenza conservata di 17 pb, nota come "CENP-B box", che si trova all'interno dei monomeri del DNA satellite centromerico di diverse specie. Studi recenti hanno confermato l'assenza di sequenze di CENP-B box nelle sottofamiglie di DNA alfa-satellite centromerico. Questi risultati supportano l'ipotesi che la funzione centromerica non dipenda dalla regione di legame della proteina CENP-B. Questo studio è stato condotto sotto la supervisione della Professoressa Elena Raimondi, presso il laboratorio di Citogenetica Molecolare dell’Università degli Studi di Pavia ed è parte di un progetto di ricerca più ampio in collaborazione con il laboratorio di Biologia Molecolare e Cellulare diretto dalla Professoressa Elena Giulotto. Il genere Equus rappresenta un modello unico per lo studio delle dinamiche e i processi alla base dello sviluppo dei centromeri. Secondo il sequenziamento completo del genoma di cavallo, il cromosoma 11 di Equus caballus presenta un centromero totalmente privo di sequenze ripetute. Questa scoperta ha portato a ipotizzare che il centromero del cromosoma 11 si sia stabilito da poco nel corso dell'evoluzione, non avendo ancora raggiunto la completa maturazione attraverso l'incorporazione del DNA satellite. Questo è stato il primo caso di un nuovo centromero evolutivo ancora immaturo. In seguito, i nostri gruppi hanno scoperto molti altri centromeri privi di satelliti nelle specie di equidi. Inoltre, abbiamo dimostrato che alcuni cromosomi di equidi non sono in grado di legare la proteina CENP-B anche se contengono sequenze di DNA satellite. Alla luce di queste argomentazioni scientifiche, il lavoro di tesi si è concentrato sul confronto tra la fedeltà di segregazione di un cromosoma di cavallo (ECA 10) il cui centromero contiene DNA satellite e lega CENP-B e quella di un cromosoma (ECA 9) che ha DNA satellite nel centromero ma manca di CENP-B box, impedendogli di legare CENP-B. A tale scopo, abbiamo utilizzato il test di aneuploidia interfasica. La frequenza di aneuploidie portate da ciascuno dei cromosomi in questione è stata valutata nei nuclei in interfase mediante analisi di FISH utilizzando sonde BAC distinte, una specifica per il cromosoma 9 e l'altra per il cromosoma 10. I risultati ottenuti hanno dimostrato che la stabilità mitotica dei due cromosomi è paragonabile, come confermato dall'analisi statistica. Abbiamo anche allestito il saggio CBMN in condizioni di controllo e di stress mitotico. Questo test avrebbe dovuto essere accoppiato alla FISH, utilizzando le stesse sonde impiegate per l'analisi interfasica, al fine di confrontare la stabilità dei cromosomi in esame e confermare i risultati precedentemente ottenuti. Purtroppo, i risultati della FISH sui micronuclei sono stati inconcludenti. In conclusione, sebbene preliminari, i presenti risultati supportano fortemente l'ipotesi che la segregazione cromosomica possa avvenire correttamente anche se la proteina CENP-B non è legata al centromero.
The role of CENP-B in centromeric stregth
DEMICHELI, MARTINA
2021/2022
Abstract
The centromere is the chromosome locus ensuring appropriate chromosome segregation during cell division, thus guaranteeing genome stability. The majority of eukaryotic centromeres include broad arrays of tandem repeats in their DNA sequence. Despite the necessity of maintaining centromere function, the centromeric DNA sequences of most species exhibited fast divergence, which means that they are not maintained across and within species. The "centromere paradox" is the name of the contradiction between function conservation and sequence divergence. The only centromeric protein that demonstrates clear specificity in binding a DNA sequence is CENP-B, which binds to a 17-bp conserved sequence known as the "CENP-B box" found inside the centromeric satellite DNA monomers of a number of species. Recent studies have confirmed the absence of CENP-B box sequences in centromeric satellite alpha DNA subfamilies. These results support the hypothesis that centromeric function is not dependent on the CENP-B protein-binding region. This study was performed under the supervision of Professor Elena Raimondi, Laboratory of Molecular Cytogenetics, University of Pavia and is part of a bigger research line carried out in conjunction with the Laboratory of Molecular and Cell Biology directed by Professor Elena Giulotto. The genus Equus is a distinctive model for examining the dynamics and processes underlying the development of centromeres. The centromere of chromosome 11 in Equus caballus is fully free of tandem repeats, according to the genome sequencing of this species. This finding led to the theory that centromere of chromosome 11 had just recently established throughout evolution, since it has not yet reached complete maturation by incorporating satellite DNA. This was the first instance of an evolutionary new centromere that was still immature. Many other satellite-free centromeres where thereafter discovered by our groups in equid species. Moreover, we demonstrated that a number of equid chromosomes are unable to bind the CENP-B protein even if they contain satellite DNA sequences. In light of these scientific arguments, this thesis work was focused on the comparison between the segregation fidelity of a horse chromosome (ECA 10) whose centromere contains satellite DNA and binds CENP-B with that of a chromosome (ECA 9) that has satellite DNA in its centromere but lacks the CENP-B box, preventing it from binding CENP-B. To do this, we used the interphase aneuploidy test. The frequency of aneuploidies carried by each of the chromosomes in issue was assessed in interphase nuclei by FISH analysis using distinct BAC probes, one unique to chromosome 9 and the other to chromosome 10. The results obtained demonstrated that the mitotic stability of the two chromosomes was comparable, as confirmed by statistical analysis. We also set up the CBMN assay under control and mitotic stress conditions. This test should have been coupled to FISH, using the same probes used for the interphase analysis, in order to compare the stability of the chromosomes under study and confirm the previously obtained results. Regrettably, the results of FISH on micronuclei were inconclusive. In conclusion, while preliminary, the present results strongly support the hypothesis that chromosome segregation can correctly occur even if the CENP-B protein is not bound to the centromere.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/15440