K1MV: a monovalent variant as a tool to investigate the stoichiometry of the K1K1 - Met interaction

Hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) and its receptor MET play an essential role in morphogenesis, growth, migration of myogenic precursor cells during embryogenesis and in adult life are involved in liver and tissue regeneration . Especially the later role in regenerative processes essential for the repair of damaged tissue in the liver, lung, skin, and other epithelial organs, makes HGF/SF an attractive molecule for therapeutic application, for example in acute or chronic liver disease. However, HGF/SF is expensive to make, was found to possess a poor in vivo distribution and is unstable with a poor shelf-life profile. These characteristics make the growth factor not suitable for regenerative medicine purposes. A splice variant, consisting of the N-terminal and the first kringle domains, NK1, was demonstrated to behave in vivo as a MET receptor agonist, is stable and easier and cheaper to produce. However, NK1 shows only partial agonistic behaviour and, interestingly, is only fully active in cells that display heparan sulphate on their surface or in the presence of soluble heparin, differently from HGF/SF itself which does not show this dependency. Heparan and heparin seem to induce dimerising of NK1 leading to a signalling-competent bivalent complex. In the optics to overcome the limitations of NK1, a newly developed recombinant receptor agonist, K1K1, a head-to-tail association of two receptor binding K1 domains connected by a four amino acids linker region, the SEVE region, was designed and created in my laboratory. The development of the K1K1 molecule started from the observation that multimerised synthetic kringle 1 domain showed strong biological activity, mimicking that of HGF/SF. The subsequent design of K1K1 was based on the NK1 dimer structure. K1K1 resulted in a potent agonist that binds to the MET receptor with the same affinity as NK1 but displays superior biological activity, equivalent to native HGF/SF. The development of K1K1 has been crucial because, differently from wild-type NK1, it does not rely on the presence of heparin to induce dimerization to offer two MET binding sites. Moreover, K1K1 showed superior activity, diffusibility, and stability at physiological pH and therefore is promising to be ideally suitable for in vivo treatment in the context of regenerative medicine. In this thesis I designed, expressed, and purified K1MV, a K1K1 variant bearing one receptor-binding deficient kringle domain. The aim of the design and development of the K1MV variant was to shed light on the type of interaction between K1K1 and MET after the discovery that a residual affinity for heparin in the kringle domains of K1K1 was necessary for its full biological activity and in the presence of heparin, K1K1 seemed to form dimers in solution, not dissimilar from NK1. My experiments with K1MV strongly suggest K1K1 does not form dimers when complexed with heparin and therefore supports the initial idea of a 1:2 interaction with the MET receptor. The role of heparin in the activation complex remains to be understood at the molecular level.

Hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) e il suo recettore MET giocano un ruolo essenziale nella morfogenesi, nella crescita, nella migrazione di precursori cellulari miogeni durante l’embriogenesi e sono coinvolti, in età adulta, nella rigenerazione tissutale e del fegato. HGF/SF è una molecola di particolare interesse per applicazioni terapeutiche specialmente per il suo ruolo nei processi riparativi di tessuti danneggiati nel fegato, polmone e pelle, insieme ad altri organi epiteliali. Tuttavia, HGF/SF è una molecola costosa da sintetizzare, possiede una non ottimale capacità di diffusione in vivo e un instabile shelf-life profile. Queste caratteristiche rendono il fattore di crescita una molecola non adatta per scopi di medicina rigenerativa. Una variante di splicing di HGF/SF, costituita dal dominio N-terminale e dal primo dominio kringle, NK1, è stata dimostrata essere in grado di comportarsi in vivo come un agonista del recettore MET, stabile, più semplice e meno costosa da produrre rispetto a HGF/SF. Nonostante ciò, NK1 ha dimostrato solo un parziale carattere agonistico e risulta essere completamente attiva solo in cellule che mostrano eparan solfato sulla loro superficie o in presenza di eparina solubile, a differenza di HGF/SF, il quale non mostra avere questa dipendenza. Eparan solfato ed eparina sembrano avere un ruolo nella dimerizzazione di NK1 portando a un complesso bivalente in grado di innescare la via di segnalazione. Nell’ottica del superamento delle limitazioni intrinseche di NK1, una nuova forma ricombinante agonista del recettore, K1K1, è stata ideata e prodotta nel mio laboratorio. K1K1 è costituito da una associazione head-to-tail di due domini K1 leganti il recettore, connessi da un linker formato da quattro amminoacidi, la regione SEVE. Lo sviluppo di K1K1 ha avuto luogo da una osservazione: un dominio multimerico K1 sintetico possiede una forte attività biologica, in grado di mimare quella di HGF/SF. Il conseguente design di K1K1 nasce pertanto dal dimero di NK1. K1K1 si è rivelato un potente agonista che lega il recettore MET con la stessa affinità di NK1 ma con una attività biologica superiore, equivalente alla molecola di HGF/SF nativa. Lo sviluppo di K1K1 è risultato essere fondamentale, inoltre, in quanto differentemente dalla molecola wild-type NK1, non richiede la presenza di eparina per indurre la dimerizzazione nell’offrire due siti di interazione MET. Oltre a quanto di cui sopra, K1K1 ha dimostrato una attività superiore, una maggiore diffusibilità e stabilità a pH fisiologico, tutte caratteristiche che la rendono una molecola adatta al trattamento in vivo nel contesto della medicina rigenerativa. In questa tesi magistrale sperimentale, ho ideato, espresso e purificato K1MV, una variante di K1K1 costituita da un sito di recettore mutato e non attivo in un dominio kringle. Lo scopo dell’ideazione e creazione della variante K1MV è stato quello di fare luce sul tipo di interazione tra K1K1 e MET, dopo la scoperta della necessità della presenza di eparina per una attività biologica completa di K1K1. In presenza di eparina, K1K1 appare in grado di creare dimeri in soluzione, un comportamento non dissimile da NK1. I miei esperimenti con K1MV suggeriscono e supportano fortemente l’idea che K1K1 non formi dimeri quando viene complessato con eparina e conseguentemente supportano l’idea iniziale di una interazione 1:2 con il recettore MET. Rimane da comprendere, a livello molecolare, il ruolo dell’eparina nell’attivazione del complesso.