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Ophthalmic infections are particularly common conditions that, if left untreated, can damage the structures of the eye until a condition of low vision or in severe cases blindness is achieved. Improperly treated ophthalmic infections can result in vision dysfunction and blindness due to (i) damage to ocular structures by release of toxins and/or degrading enzymes by the bacteria involved (ii) insult by inflammatory response by massive influx of inflammatory cells into the posterior segment of the eyeball. Although the treatment of bacterial ocular infections is primarily empirical (with the intent of avoiding therapeutic delays and/or limiting costs), effective long-term management cannot be achieved without identification of the etiologic agent, and knowledge of the epidemiologic antibiotic-sensitivity data present locally. The most commonly used antibiotics for the treatment of ocular infections caused by Staphylococcus aureus are represented by Levofloxacin (LEV), Chloramphenicol (CAF), Tobramycin (TOB), Netilmycin (NET), and Vancomycin. Staphylococcus aureus represents the species most commonly involved in ocular infections of varying severity (70%), such as abscesses in the eyelid or periorbital area, foreign body keratitis (e.g., from contact lenses), or pseudopathic endophthalmitis following placement of intraocular lenses or other devices. What makes Staphylococcus aureus particularly capable of leading to such diseases is its ability to form biofilms, a structure that allows it to persist in the host and escape the action of antibiotics. Given the severity of ocular infections caused by S. aureus, as well as the paucity of data regarding microbiological investigations (identification of infection-causing agents and their antibiograms) and the ability to produce biofilms by strains of ophthalmic origin, the experimental design conducted involved evaluating the ability to form biofilms of 45 isolates of S. aureus (14/45 methicillin-resistant, MRSA, and 31/45 methicillin-sensitive, MSSA), obtained in the period 2017-2021 from ocular sites and identified at three Clinical Microbiology Laboratories located in Lombardy (Ospedale A. Manzoni, Lecco; ASST Fatebenefratelli Sacco, Milan; and Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia). An additional objective of the present work was to obtain point values of Minimum Inhibitory Concentration (MIC), using the broth microdilution reference method for the four antibiotics mentioned above. The ability of S. aureus isolates to produce biofilm by Cristalviolet assay (CVA) was also evaluated, the effect of sub-inhibitory concentrations of the four antibiotics on cell adhesion of selected MSSA isolates was assessed, and finally, the ability of the antibiotics to eradicate biofilm (MBEC) produced by the Calgary method was evaluated. The results of this research confirmed that n=43/45 isolates were sensitive to CAF, n=33/45 to LEV, n=32/45 to TOB and n=28/45 sensitive to NET. In addition, all isolates showed MICs of 8 mg/L for CAF, and MICs of 0.125 and 0.25 mg/L for LEV, NET and TOB. An increase in bacterial adhesion was observed at sub-MIC concentrations of each antibiotic and equal to 0.5 mg/L for CAF, 0.03 mg/L for LEV, 0.125 mg/L for NET, and 0.03 mg/L for TOB. Complete inhibition of biofilm formation was obtained in the presence of 8 mg/L for CAF, 0.125 mg/L for LEV, 0.25 mg/L for NET and 0.06 mg/L for TOB. MBEC values were 512 mg/L for CAF, 128-2048 mg/L for LEV, 256 mg/L for NET and 32-64 mg/L for TOB. In conclusion: CAF, LEV (with one exception), NET and TOB were effective in vitro in eradicating biofilms in S. aureus strains sensitive to these molecules. Keywords: Staphylococcus aureus, ocular infections, MIC, Biofilms, MBEC.

Le infezioni oculari sono patologie particolarmente frequenti che, se non trattate, possono danneggiare le strutture dell’occhio fino al raggiungimento di una condizione di ipovisione o nei casi più gravi cecità. Le infezioni oftalmiche non correttamente trattate possono esitare in disfunzioni nella visione e cecità dovute a i) danno alle strutture oculari per rilascio di tossine e/o enzimi degradativi da parte dei batteri coinvolti ii) insulto da risposta infiammatoria per afflusso massivo di cellule infiammatorie nel segmento posteriore del bulbo oculare. Sebbene il trattamento delle infezioni oculari batteriche sia principalmente empirico (nell’intento di evitare ritardi terapeutici e/o limitare i costi), una gestione efficace a lungo termine non può prescindere dall’identificazione dell’agente eziologico, e dalla conoscenza dei dati epidemiologici di antibiotico-sensibilità presenti a livello locale. Gli antibiotici più comunemente utilizzati per il trattamento delle infezioni oculari causate da Staphylococcus aureus sono rappresentati da Levofloxacina (LEV), Cloramfenicolo (CAF), Tobramicina (TOB), Netilmicina (NET) e Vancomicina. S.aureus rappresenta la specie maggiormente coinvolta in infezioni oculari di differente gravità (70%), quali ascessi in sede palpebrale o in area periorbitale, cheratiti da corpo estraneo o endoftalmiti pseudopatiche successive a posizionamento di lenti intra-oculari o altri devices. A rendere S. aureus particolarmente capace di determinare tali patologie è la sua abilità di formare biofilm, una struttura che consente a quest’ultimo di persistere nell’ospite e sfuggire all’azione degli antibiotici. Data la gravità delle infezioni oculari causate da S. aureus, nonché la scarsità di dati riguardo indagini microbiologiche e la capacità di produrre biofilm da parte di ceppi di origine oftalmica, il disegno sperimentale condotta ha previsto la valutazione della capacità di formare biofilm di 45 isolati di S. aureus (14/45 meticillino-resistenti, MRSA, e 31/45 meticillino-sensibili, MSSA), ottenuti nel periodo 2017-2021 da sede oculare e identificati presso tre Laboratori di Microbiologia Clinica siti in Lombardia (Ospedale A. Manzoni, Lecco; ASST Fatebenefratelli Sacco, Milano e Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia). Un ulteriore obiettivo del presente lavoro è stato quello di ottenere valori puntuali di MIC, utilizzando il metodo di riferimento microdiluzione in brodo per i quattro antibiotici sopra menzionati. È stata inoltre valutata la capacità degli isolati di S. aureus di produrre biofilm mediante Cristalvioletto assay (CVA), si è valutato l’effetto di concentrazioni sub-inibitorie dei quattro antibiotici sull’adesione cellulare di isolati selezionati di MSSA ed infine è stata valutata la capacità degli antibiotici di eradicare il biofilm (MBEC) prodotto mediante il metodo Calgary. I risultati di tale ricerca hanno confermato che n=43/45 isolati sono sensibili a CAF, n=33/45 a LEV, n=32/45 a TOB e n=28/45 sensibili a NET. Inoltre, tutti gli isolati hanno mostrato una MIC pari a 8 mg/L per CAF, e MIC pari a 0.125 e 0.25 mg/L per LEV, NET e TOB. Si è osservato un aumento dell’adesione batterica a concentrazioni sub-MIC di ciascun antibiotico e pari a 0.5 mg/L per CAF, 0.03 mg/L per LEV, 0.125 mg/L per NET e 0.03 mg/L per TOB. Una completa inibizione della formazione di biofilm è stata ottenuta in presenza di 8 mg/L per CAF, 0.125 mg/L per LEV, 0.25 mg/L per NET e 0.06 mg/L per TOB. I valori MBEC sono risultati pari a 512 mg/L per CAF, 128-2048 mg/L per LEV, 256 mg/L per NET e 32-64 mg/L per TOB. In conclusione: CAF, LEV (con una eccezione), NET e TOB sono risultati efficaci in vitro nell’eradicazione dei biofilm in ceppi di S. aureus sensibili a tali molecole. Parole chiave: S. aureus, infezioni oculari, MIC, Biofilm

Andamento dell'anti-microbico resistenza in isolati da sede oculare: ruolo del biofilm

BORGHESI, LUDOVICA
2021/2022

Abstract

Ophthalmic infections are particularly common conditions that, if left untreated, can damage the structures of the eye until a condition of low vision or in severe cases blindness is achieved. Improperly treated ophthalmic infections can result in vision dysfunction and blindness due to (i) damage to ocular structures by release of toxins and/or degrading enzymes by the bacteria involved (ii) insult by inflammatory response by massive influx of inflammatory cells into the posterior segment of the eyeball. Although the treatment of bacterial ocular infections is primarily empirical (with the intent of avoiding therapeutic delays and/or limiting costs), effective long-term management cannot be achieved without identification of the etiologic agent, and knowledge of the epidemiologic antibiotic-sensitivity data present locally. The most commonly used antibiotics for the treatment of ocular infections caused by Staphylococcus aureus are represented by Levofloxacin (LEV), Chloramphenicol (CAF), Tobramycin (TOB), Netilmycin (NET), and Vancomycin. Staphylococcus aureus represents the species most commonly involved in ocular infections of varying severity (70%), such as abscesses in the eyelid or periorbital area, foreign body keratitis (e.g., from contact lenses), or pseudopathic endophthalmitis following placement of intraocular lenses or other devices. What makes Staphylococcus aureus particularly capable of leading to such diseases is its ability to form biofilms, a structure that allows it to persist in the host and escape the action of antibiotics. Given the severity of ocular infections caused by S. aureus, as well as the paucity of data regarding microbiological investigations (identification of infection-causing agents and their antibiograms) and the ability to produce biofilms by strains of ophthalmic origin, the experimental design conducted involved evaluating the ability to form biofilms of 45 isolates of S. aureus (14/45 methicillin-resistant, MRSA, and 31/45 methicillin-sensitive, MSSA), obtained in the period 2017-2021 from ocular sites and identified at three Clinical Microbiology Laboratories located in Lombardy (Ospedale A. Manzoni, Lecco; ASST Fatebenefratelli Sacco, Milan; and Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia). An additional objective of the present work was to obtain point values of Minimum Inhibitory Concentration (MIC), using the broth microdilution reference method for the four antibiotics mentioned above. The ability of S. aureus isolates to produce biofilm by Cristalviolet assay (CVA) was also evaluated, the effect of sub-inhibitory concentrations of the four antibiotics on cell adhesion of selected MSSA isolates was assessed, and finally, the ability of the antibiotics to eradicate biofilm (MBEC) produced by the Calgary method was evaluated. The results of this research confirmed that n=43/45 isolates were sensitive to CAF, n=33/45 to LEV, n=32/45 to TOB and n=28/45 sensitive to NET. In addition, all isolates showed MICs of 8 mg/L for CAF, and MICs of 0.125 and 0.25 mg/L for LEV, NET and TOB. An increase in bacterial adhesion was observed at sub-MIC concentrations of each antibiotic and equal to 0.5 mg/L for CAF, 0.03 mg/L for LEV, 0.125 mg/L for NET, and 0.03 mg/L for TOB. Complete inhibition of biofilm formation was obtained in the presence of 8 mg/L for CAF, 0.125 mg/L for LEV, 0.25 mg/L for NET and 0.06 mg/L for TOB. MBEC values were 512 mg/L for CAF, 128-2048 mg/L for LEV, 256 mg/L for NET and 32-64 mg/L for TOB. In conclusion: CAF, LEV (with one exception), NET and TOB were effective in vitro in eradicating biofilms in S. aureus strains sensitive to these molecules. Keywords: Staphylococcus aureus, ocular infections, MIC, Biofilms, MBEC.
DIPARTIMENTO DI MEDICINA MOLECOLARE
2021
trends of anti-microbial resistance in ocular site isolates: role of biofilm
Le infezioni oculari sono patologie particolarmente frequenti che, se non trattate, possono danneggiare le strutture dell’occhio fino al raggiungimento di una condizione di ipovisione o nei casi più gravi cecità. Le infezioni oftalmiche non correttamente trattate possono esitare in disfunzioni nella visione e cecità dovute a i) danno alle strutture oculari per rilascio di tossine e/o enzimi degradativi da parte dei batteri coinvolti ii) insulto da risposta infiammatoria per afflusso massivo di cellule infiammatorie nel segmento posteriore del bulbo oculare. Sebbene il trattamento delle infezioni oculari batteriche sia principalmente empirico (nell’intento di evitare ritardi terapeutici e/o limitare i costi), una gestione efficace a lungo termine non può prescindere dall’identificazione dell’agente eziologico, e dalla conoscenza dei dati epidemiologici di antibiotico-sensibilità presenti a livello locale. Gli antibiotici più comunemente utilizzati per il trattamento delle infezioni oculari causate da Staphylococcus aureus sono rappresentati da Levofloxacina (LEV), Cloramfenicolo (CAF), Tobramicina (TOB), Netilmicina (NET) e Vancomicina. S.aureus rappresenta la specie maggiormente coinvolta in infezioni oculari di differente gravità (70%), quali ascessi in sede palpebrale o in area periorbitale, cheratiti da corpo estraneo o endoftalmiti pseudopatiche successive a posizionamento di lenti intra-oculari o altri devices. A rendere S. aureus particolarmente capace di determinare tali patologie è la sua abilità di formare biofilm, una struttura che consente a quest’ultimo di persistere nell’ospite e sfuggire all’azione degli antibiotici. Data la gravità delle infezioni oculari causate da S. aureus, nonché la scarsità di dati riguardo indagini microbiologiche e la capacità di produrre biofilm da parte di ceppi di origine oftalmica, il disegno sperimentale condotta ha previsto la valutazione della capacità di formare biofilm di 45 isolati di S. aureus (14/45 meticillino-resistenti, MRSA, e 31/45 meticillino-sensibili, MSSA), ottenuti nel periodo 2017-2021 da sede oculare e identificati presso tre Laboratori di Microbiologia Clinica siti in Lombardia (Ospedale A. Manzoni, Lecco; ASST Fatebenefratelli Sacco, Milano e Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia). Un ulteriore obiettivo del presente lavoro è stato quello di ottenere valori puntuali di MIC, utilizzando il metodo di riferimento microdiluzione in brodo per i quattro antibiotici sopra menzionati. È stata inoltre valutata la capacità degli isolati di S. aureus di produrre biofilm mediante Cristalvioletto assay (CVA), si è valutato l’effetto di concentrazioni sub-inibitorie dei quattro antibiotici sull’adesione cellulare di isolati selezionati di MSSA ed infine è stata valutata la capacità degli antibiotici di eradicare il biofilm (MBEC) prodotto mediante il metodo Calgary. I risultati di tale ricerca hanno confermato che n=43/45 isolati sono sensibili a CAF, n=33/45 a LEV, n=32/45 a TOB e n=28/45 sensibili a NET. Inoltre, tutti gli isolati hanno mostrato una MIC pari a 8 mg/L per CAF, e MIC pari a 0.125 e 0.25 mg/L per LEV, NET e TOB. Si è osservato un aumento dell’adesione batterica a concentrazioni sub-MIC di ciascun antibiotico e pari a 0.5 mg/L per CAF, 0.03 mg/L per LEV, 0.125 mg/L per NET e 0.03 mg/L per TOB. Una completa inibizione della formazione di biofilm è stata ottenuta in presenza di 8 mg/L per CAF, 0.125 mg/L per LEV, 0.25 mg/L per NET e 0.06 mg/L per TOB. I valori MBEC sono risultati pari a 512 mg/L per CAF, 128-2048 mg/L per LEV, 256 mg/L per NET e 32-64 mg/L per TOB. In conclusione: CAF, LEV (con una eccezione), NET e TOB sono risultati efficaci in vitro nell’eradicazione dei biofilm in ceppi di S. aureus sensibili a tali molecole. Parole chiave: S. aureus, infezioni oculari, MIC, Biofilm
PIAZZA, AURORA
Lauree Magistrali
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