ABSTRACT (eng) Current research in cancer metabolism heavily relies on cellular models. However, there are several discrepancies between routine mammalian cell culture conditions and the in vivo tumour microenvironment, one of the most striking being the nutrient composition to which cells are exposed. Indeed, while the extracellular environment of cancer cells is typically described as nutrient-deprived, commercial media are formulated with supraphysiological nutrient concentrations. Recent studies showed that these non-physiological cell culture conditions misshape the metabolism of cancer cells in vitro and produce undesired metabolic artefacts. In this thesis, I investigated whether this applies also to a cellular model of Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Cancer (HLRCC), a cancer predisposition syndrome caused by loss of the metabolic enzyme fumarate hydratase (FH). To answer this question, I used a standard cell culture medium (DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle Medium) and a novel culture medium resembling the metabolic composition of human plasma (Plasmax). Firstly, I performed a comprehensive characterisation of the metabolic composition of both culture media by means of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)-based metabolomics to identify metabolic features that could potentially be relevant in our model. Then, I assessed metabolic rewiring and oncogenic signalling in FH-deficient human renal epithelial cell lines cultured in the two media. Overall, I demonstrate that the main signatures of FH loss are not influenced by the medium composition, hence proving that FH loss is a stronger phenotypic driver than nutritional cues. This comparative approach will provide a better understanding of the metabolic reprogramming upon FH-loss in vivo.

I modelli cellulari sono uno dei pilastri della ricerca oncologica. Tuttavia, ci sono notevoli discrepanze tra le comuni condizioni di coltura delle linee cellulari e il microambiente tumorale in vivo. Fra tutte, una delle più evidenti è la disponibilità di nutrienti a cui le cellule possono attingere. Infatti, mentre l'ambiente extracellulare delle cellule tumorali è tipicamente descritto come povero di nutrienti, i comuni mezzi di coltura sono formulati con concentrazioni di nutrienti che eccedono volutamente quelle riscontrate in vivo in modo da sostenere la crescita delle linee cellulari e facilitare lo svolgimento degli esperimenti. Studi recenti hanno dimostrato che condizioni di coltura troppo lontane da quelle fisiologiche alterano il metabolismo e il fenotipo delle cellule tumorali in coltura. Questo lavoro si propone di determinare se tali alterazioni metaboliche e fenotipiche possono essere riscontrati anche in un modello cellulare di leiomiomatosi ereditaria e cancro a cellule renali (HLRCC – Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Cancer), una rara sindrome dovuta a mutazioni del gene codificante per l’enzima metabolico fumarasi. Per rispondere a questa domanda, mi sono avvalsa di un mezzo di coltura standard (DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium) e di un nuovo terreno di coltura sviluppato per riprodurre la composizione metabolica del plasma umano (Plasmax). In primo luogo, ho caratterizzato la composizione metabolica di entrambi i mezzi di coltura mediante cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa per identificare caratteristiche metaboliche potenzialmente rilevanti per il nostro modello. Successivamente, ho coltivato nei due diversi mezzi di coltura cellule epiteliali renali umane che non esprimono la fumarasi, e ne ho valutato l’alterazione del metabolismo e l’attivazione di meccanismi pro-oncogenici caratteristici della perdita di fumarasi. I risultati ottenuti dimostrano che le caratteristiche risposte cellulari alla perdita di fumarasi non sono influenzate dalla composizione del terreno di coltura, dimostrando così che la perdita di fumarasi è un driver fenotipico più forte della disponibilità di nutrienti. In questo modo, questo approccio comparativo consente di comprendere meglio la riprogrammazione metabolica che si verifica in pazienti affetti da HLRCC.

EFFETTI BIOLOGICI DELLA COMPOSIZIONE DEL MEZZO DI COLTURA SU UN MODELLO CELLULARE DI CANCRO CAUSATO DA PERDITA DI FUMARASI

COLAPIETRO, ROBERTA
2021/2022

Abstract

ABSTRACT (eng) Current research in cancer metabolism heavily relies on cellular models. However, there are several discrepancies between routine mammalian cell culture conditions and the in vivo tumour microenvironment, one of the most striking being the nutrient composition to which cells are exposed. Indeed, while the extracellular environment of cancer cells is typically described as nutrient-deprived, commercial media are formulated with supraphysiological nutrient concentrations. Recent studies showed that these non-physiological cell culture conditions misshape the metabolism of cancer cells in vitro and produce undesired metabolic artefacts. In this thesis, I investigated whether this applies also to a cellular model of Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Cancer (HLRCC), a cancer predisposition syndrome caused by loss of the metabolic enzyme fumarate hydratase (FH). To answer this question, I used a standard cell culture medium (DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle Medium) and a novel culture medium resembling the metabolic composition of human plasma (Plasmax). Firstly, I performed a comprehensive characterisation of the metabolic composition of both culture media by means of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)-based metabolomics to identify metabolic features that could potentially be relevant in our model. Then, I assessed metabolic rewiring and oncogenic signalling in FH-deficient human renal epithelial cell lines cultured in the two media. Overall, I demonstrate that the main signatures of FH loss are not influenced by the medium composition, hence proving that FH loss is a stronger phenotypic driver than nutritional cues. This comparative approach will provide a better understanding of the metabolic reprogramming upon FH-loss in vivo.
2021
Biological effects of culture medium composition on a cellular model of cancer induced by fumarate-hydratase loss
I modelli cellulari sono uno dei pilastri della ricerca oncologica. Tuttavia, ci sono notevoli discrepanze tra le comuni condizioni di coltura delle linee cellulari e il microambiente tumorale in vivo. Fra tutte, una delle più evidenti è la disponibilità di nutrienti a cui le cellule possono attingere. Infatti, mentre l'ambiente extracellulare delle cellule tumorali è tipicamente descritto come povero di nutrienti, i comuni mezzi di coltura sono formulati con concentrazioni di nutrienti che eccedono volutamente quelle riscontrate in vivo in modo da sostenere la crescita delle linee cellulari e facilitare lo svolgimento degli esperimenti. Studi recenti hanno dimostrato che condizioni di coltura troppo lontane da quelle fisiologiche alterano il metabolismo e il fenotipo delle cellule tumorali in coltura. Questo lavoro si propone di determinare se tali alterazioni metaboliche e fenotipiche possono essere riscontrati anche in un modello cellulare di leiomiomatosi ereditaria e cancro a cellule renali (HLRCC – Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Cancer), una rara sindrome dovuta a mutazioni del gene codificante per l’enzima metabolico fumarasi. Per rispondere a questa domanda, mi sono avvalsa di un mezzo di coltura standard (DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium) e di un nuovo terreno di coltura sviluppato per riprodurre la composizione metabolica del plasma umano (Plasmax). In primo luogo, ho caratterizzato la composizione metabolica di entrambi i mezzi di coltura mediante cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa per identificare caratteristiche metaboliche potenzialmente rilevanti per il nostro modello. Successivamente, ho coltivato nei due diversi mezzi di coltura cellule epiteliali renali umane che non esprimono la fumarasi, e ne ho valutato l’alterazione del metabolismo e l’attivazione di meccanismi pro-oncogenici caratteristici della perdita di fumarasi. I risultati ottenuti dimostrano che le caratteristiche risposte cellulari alla perdita di fumarasi non sono influenzate dalla composizione del terreno di coltura, dimostrando così che la perdita di fumarasi è un driver fenotipico più forte della disponibilità di nutrienti. In questo modo, questo approccio comparativo consente di comprendere meglio la riprogrammazione metabolica che si verifica in pazienti affetti da HLRCC.
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14239/15574