SARS-CoV-2 is a new type of Coronavirus responsible for the COVID-19 pandemic. Upon infection, the injured tissues recruit macrophages and neutrophils, which can promote endothelial and epithelial damage because of the abundant release of reactive oxygen species (ROS) and proteases. The most critical protease is human neutrophil elastase (HNE) which plays a very important role of protection against microorganisms but, at the same time, is responsible for the lung parenchyma damaging. In healthy individuals this protease is counteracted by its natural inhibitor, alpha-1 antitrypsin (AAT), that binds covalently with it, forming a stable complex. Our studies demonstrated that the formation of this complex doesn’t occur in subjects affected by COVID-19. Instead, it can be observed that HNE complexes with other proteins and remains active, whereas a “portion” of AAT is implicated in the binding of NETs and an amount of it remains free. The starting point of this work was to investigate what happens to the free AAT. Considering that an over expression of HNE and pro-inflammatory cytokines generates a hypoxic environment at the level of lung parenchyma whose consequence is the release of high concentrations of ROS and of reactive nitrogen species (RSN), the explored hypothesis was that these species may cause the oxidation of AAT, with a consequent conformational change of the inhibitor resulting in a minimal or null anti-elastase activity. Therefore, studies were conducted on BALf and plasma samples from COVID-19 patients to confirm AAT oxidation. Later, we questioned if this process could have effects on the secondary structure of the antiprotease submitting the protein to circular dichroism analysis. The analysis confirmed a remarkable loss of the helical content in the COVID samples. This suggests a conformational change of the protein. The generation of a mutated AAT to make it resistant to oxidation and the effect of two synthetic inhibitors of HNE (Alvelestat and Sivelestat) were the roads we have explored to evaluate in vitro alternative HNE inhibitors that can replace AAT action.
SARS-CoV-2 è un nuovo tipo di Coronavirus responsabile della pandemia COVID-19. Al momento dell'infezione, i tessuti danneggiati reclutano macrofagi e neutrofili, che possono promuovere danni endoteliali ed epiteliali a causa dell'abbondante rilascio di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e proteasi. La proteasi più critica è l'elastasi neutrofila umana (HNE), che svolge un ruolo di protezione contro i microrganismi molto importante ma, allo stesso tempo, è responsabile del danneggiamento del parenchima polmonare. Negli individui sani questa proteasi è contrastata dal suo inibitore naturale, l'alfa-1 antitripsina (AAT), che si lega covalentemente ad essa, formando un complesso stabile. I nostri studi hanno dimostrato che nei soggetti affetti da COVID-19 la formazione di questo complesso non avviene. Si osserva invece che l'HNE si complessa con altre proteine e rimane attiva, mentre una "porzione" di AAT è implicata nel legame con i NET e una parte di essa rimane libera. Il punto di partenza di questo lavoro è stato quello di indagare cosa succede all'AAT libera. Considerando che una sovra-espressione di HNE e di citochine pro-infiammatorie genera un ambiente ipossico a livello del parenchima polmonare la cui conseguenza è il rilascio di elevate concentrazioni di ROS e di specie reattive dell'azoto (RSN), l'ipotesi esplorata è stata che queste specie possano causare l'ossidazione dell'AAT, con un conseguente cambiamento conformazionale dell'inibitore che si traduce in un'attività anti-elastasi minima o nulla. Pertanto, sono stati condotti studi su campioni di BALf e plasma di pazienti COVID-19 per confermare l'ossidazione dell'AAT. Successivamente, ci siamo chiesti se questo processo potesse avere effetti sulla struttura secondaria dell'antiproteasi sottoponendo la proteina ad analisi di dicroismo circolare. L'analisi ha confermato una notevole perdita del contenuto di α-eliche nei campioni COVID. Ciò suggerisce un cambiamento conformazionale della proteina. La generazione di un AAT mutata per renderla resistente all'ossidazione e l'effetto di due inibitori sintetici dell'HNE (Alvelestat e Sivelestat) sono state le strade che abbiamo esplorato per valutare in vitro inibitori alternativi dell'HNE che possano sostituire l'azione dell'AAT.
Studio di differenti strategie inibitorie per l’Elastasi Neutrofila Umana in pazienti affetti da COVID-19
BIGNAMI, PAOLA MARGHERITA
2021/2022
Abstract
SARS-CoV-2 is a new type of Coronavirus responsible for the COVID-19 pandemic. Upon infection, the injured tissues recruit macrophages and neutrophils, which can promote endothelial and epithelial damage because of the abundant release of reactive oxygen species (ROS) and proteases. The most critical protease is human neutrophil elastase (HNE) which plays a very important role of protection against microorganisms but, at the same time, is responsible for the lung parenchyma damaging. In healthy individuals this protease is counteracted by its natural inhibitor, alpha-1 antitrypsin (AAT), that binds covalently with it, forming a stable complex. Our studies demonstrated that the formation of this complex doesn’t occur in subjects affected by COVID-19. Instead, it can be observed that HNE complexes with other proteins and remains active, whereas a “portion” of AAT is implicated in the binding of NETs and an amount of it remains free. The starting point of this work was to investigate what happens to the free AAT. Considering that an over expression of HNE and pro-inflammatory cytokines generates a hypoxic environment at the level of lung parenchyma whose consequence is the release of high concentrations of ROS and of reactive nitrogen species (RSN), the explored hypothesis was that these species may cause the oxidation of AAT, with a consequent conformational change of the inhibitor resulting in a minimal or null anti-elastase activity. Therefore, studies were conducted on BALf and plasma samples from COVID-19 patients to confirm AAT oxidation. Later, we questioned if this process could have effects on the secondary structure of the antiprotease submitting the protein to circular dichroism analysis. The analysis confirmed a remarkable loss of the helical content in the COVID samples. This suggests a conformational change of the protein. The generation of a mutated AAT to make it resistant to oxidation and the effect of two synthetic inhibitors of HNE (Alvelestat and Sivelestat) were the roads we have explored to evaluate in vitro alternative HNE inhibitors that can replace AAT action.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/15579