IDENTIFICAZIONE DI SOTTOPOPOLAZIONI IMMUNOSOPPRESSIVE NEL MICROAMBIENTE DEL GLIOBLASTOMA IMPLICATE NEL PROCESSO DI EXHAUSTION DEI LINFOCITI INFILTRANTI E REATTIVI CONTRO IL TUMORE.

Il GBM, un tumore cerebrale devastante caratterizzato da una prognosi infausta, può contare su un ecosistema molto organizzato, noto come microambiente tumorale (TME), dove cellule neoplastiche e non neoplastiche comunicano tra loro. Le cellule tumorali corrompono le cellule non neoplastiche all'interno del microambiente e lo sfruttano per sostenere la loro crescita e per sviluppare resistenza alle terapie. Il GBM è per lo più infiltrato da cellule immunitarie dell’immunità innata, tra le quali i macrofagi rappresentano la componente più abbondante. All'interno del TME si trovano anche i linfociti T, potenzialmente in grado di riconoscere e combattere le cellule tumorali. I linfociti T (chiamati anche linfociti T infiltranti il tumore-TIL) in seguito all’incontro con le cellule tumorali, e sotto l’attacco di fattori immunosoppressivi provenienti dal TME possono andare incontro ad un processo di ipofunzionalità definito exhaustion. I TILs, dopo l’incontro con il tumore, possono sviluppare una memoria immunologica e provenendo direttamente dal tumore, riconoscono molti bersagli sulle cellule tumorali. Questo li rende una terapia molto attraente anche per un tumore molto aggressivo come il GBM. Il TME può essere determinante nel favorire un processo di exhaustion irreversibile dei TILs, rendendo impossibile una loro efficacia clinica. Alla luce di questo, abbiamo deciso di sottoporre a caratterizzazione con single cell RNA sequencing sia i TILs reattivi contro il tumore, esprimenti un tipico marcatore di reattività, il CD137, sia il TME in diretto contatto con essi. Un’analisi bioinformatica preliminare ci ha permesso di definire differenti sottopopolazioni cellulari, tra cui più abbondanti neutrofili e macrofagi, distinti in monocita- o microglia- derivati. È emerso inoltre che tra il TILs esprimenti CD137 sono presenti cellule T regolatorie, potenzialmente immunosoppressive. In parallelo, abbiamo condotto un’analisi citofluorimetrica per confermare queste osservazioni. I marcatori HLA-DR e CD49d ci hanno permesso di distinguere la microglia, popolazione autoctona quindi negativa per CD49d, dai macrofagi. Abbiamo inoltre distinto i macrofagi in monocita-derivati e microglia derivati sfruttando i marcatori CD45 e CD11b. La quantificazione di queste sottopopolazioni ci ha permesso di distinguere due sottotipi di microambiente che sono stati correlati con la capacità dei TILs di espandersi in vitro. Di notevole interesse è, inoltre, la presenza delle Treg, cellule già note per il loro ruolo immunosoppressivo nel GBM; tuttavia, meno indagate rispetto alla componente mieloide/macrofagica. Considerato che anch’esse esprimono CD137 e che per questo vengono arricchite insieme alla componente dei TILs reattivi contro il tumore, ci siamo chiesti se, quando più abbondanti, potessero compromettere la capacità dei TILs ad espandersi in vitro. Sfruttando il protocollo di espansione già ottimizzato che prevede attivazione con feeder e anticorpo monoclonale anti-CD3, ed espansione con un terreno specifico con IL-15, IL7 e IL-21 abbiamo monitorato a diversi tempi l’immunofenotipo dei TILs per valutare la persistenza delle Treg. In parallelo, come controllo abbiamo espanso gli stessi campioni supplementando il terreno con la sola IL-2, citochina fondamentale per il mantenimento delle Treg. I risultati ottenuti da tre diversi campioni di TME hanno mostrato che le Treg persistono nelle prime fasi di espansione quando coltivate con IL-2, scomparendo a tempi più tardivi. La presenza di IL-15 IL-7 e IL-21 fa prevalere precocemente la componente reattiva contro il tumore potenzialmente terapeutica. Ulteriori indagini sono necessarie per definire se la coesistenza e l’interazione delle Treg e dei TILs reattivi contro il tumore nel TME possa pregiudicare lo stato di funzionalità di quest’ultimi, con un impatto negativo sulla realizzazione di una terapia personalizzata per pazienti affetti da GBM.