Un modello transgenico nel topo per l'ablazione di cellule mieloidi PD-L2+ nella neuroinfiammazione sperimentale

Multiple sclerosis (MS) is the most common autoimmune inflammatory disease of the central nervous system (CNS). MS pathogenesis is complex and involves several cell populations of both the innate and adaptive immune systems. In recent years, interest in neuroinflammation has grown in a population that has long been neglected, namely neutrophils. The neutrophil-to-lymphocyte ratio has been proposed as a marker of disease activity in patients with relapsing-remitting forms of MS. Recent studies have revealed the presence of neutrophils with immunosuppressive functions in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a preclinical MS model. Dr. Furlan’s group recently identified a neutrophil subpopulation that expresses the surface marker PD-L2 (or CD273), a ligand of the programmed cell death-1 receptor (PD-1). PD-L2+ neutrophils were found in the blood of both healthy controls and patients with MS and increased in number in the second group, especially in the acute phase of the disease. As this neutrophil subtype has not yet been characterized in the context of MS, the group proposed to fully characterize its phenotype and uncover its function. PD-L2+ neutrophils express surface markers typically associated with regulatory functions in humans, and when co-cultured with lymphocytes ex vivo, they exert a suppressive effect on T cell proliferation. This thesis focused on the in vivo murine counterpart of this study. First, the presence of PD-L2+ neutrophils in mice with EAE was confirmed, and the kinetics of these neutrophils during the disease was described. The aim of this thesis project was to develop transgenic mouse models that would allow PD-L2+ myeloid cell depletion during EAE. We characterized the genotypes of the original strains and crossed subsequent generations of mice to obtain the appropriate transgenic model. We successfully depleted PD-L2+ myeloid cells in EAE mice by crossing two transgenic mouse models described in this thesis. The depletion of PD-L2+ myeloid cells, including neutrophils, contributed to the worsening of the disease course. Therefore, we hypothesized that PD-L2 may be a suitable candidate for identifying regulatory neutrophils with protective functions in both EAE and MS. Understanding the importance of regulatory neutrophils in neuroinflammation could lead to the identification of alternative strategies for disease control, and consequently, to the identification of new therapeutic targets.

La Sclerosi Multipla (SM) è la più comune malattia infiammatoria a base autoimmune del Sistema Nervoso Centrale (SNC). La patogenesi della SM è molto complessa e coinvolge diverse popolazioni cellulari sia del sistema immunitario innato sia di quello adattativo. Negli ultimi anni si è assistito ad un crescente interesse nei confronti di una popolazione fino ad ora trascurata, i neutrofili. Il rapporto tra neutrofili e linfociti è stato proposto come marcatore di attività di malattia in pazienti con forme recidivanti-remittenti di SM. Alcuni studi recenti hanno inoltre rivelato l'esistenza di neutrofili con ruoli immunosoppressivi nel modello preclinico di SM, l’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAS). Nel nostro laboratorio è stata recentemente identificata una sottopopolazione di neutrofili che esprime il marker di superficie PD-L2 (o CD273), ligando del recettore di morte programmata-1 (PD-1). Neutrofili PD-L2+ sono stati trovati sia nel sangue di controlli sani che in pazienti affetti da SM, aumentati in numero nel secondo gruppo, soprattutto nella fase acuta della malattia. Dal momento che non esiste ancora una caratterizzazione di questa sottopopolazione di neutrofili nei pazienti con SM, il gruppo del Dr. Furlan si è proposto di studiarne il fenotipo e di comprenderne le funzioni. I neutrofili PD-L2+ esprimono marcatori di superficie tipicamente associati a funzioni immunosoppressive nell'uomo e, quando coltivati ex-vivo insieme a linfociti, esercitano un’azione soppressiva sulla proliferazione delle cellule T. In questo studio ci siamo soffermati sulla controparte in vivo del progetto. In primo luogo, è stata confermata la presenza di neutrofili PD-L2+ anche nei topi con EAS e ne è stata descritta la relativa cinetica nel corso della malattia. Lo scopo del progetto di tesi è stato la messa a punto di modelli transgenici murini che permettessero l’eliminazione delle cellule mieloidi PD-L2+ durante l’EAS. In particolare, ho caratterizzato il genotipo dei ceppi originari e dei successivi incroci, sino ad ottenere il modello voluto. Infatti, incrociando due dei tre modelli di topi transgenici descritti nella tesi, abbiamo eliminato con successo le cellule mieloidi PD-L2+ per comprenderne il ruolo nelle diverse fasi della patogenesi del processo autoimmune. L’ablazione delle cellule mieloidi PD-L2+, tra cui i neutrofili, ha contribuito a peggiorare il decorso della malattia. Abbiamo quindi ipotizzato che il PD-L2 possa essere un buon candidato per identificare neutrofili regolatori con una funzione protettiva sia nell’EAS che nella SM. Comprendere l’importanza delle funzioni regolatrici dei neutrofili in neuroinfiammazione potrebbe portare all’identificazione di vie fondamentali per il controllo della malattia e, di conseguenza, all’identificazione di nuovi target terapeutici.