Valutazione dell'attività della prolil-4-idrossilasi per la produzione di collagene per via ricombinante mediante tecniche cromatografiche e di spettrometria di massa

Il collagene è una proteina strutturale con caratteristiche uniche, grazie alle quali trova diverse applicazioni nell'industria alimentare, cosmetica, farmaceutica e biomedica. L’estrazione da fonti animali è la via produttiva più comune, ma in ambito farmaceutico la produzione di collagene umano per via ricombinante rappresenta un’importante opportunità da sviluppare. L’interesse farmaceutico verso l’ottenimento per via ricombinante del collagene richiede lo sviluppo di metodi analitici adeguati, in grado di caratterizzare tutti i molteplici aspetti strutturali del collagene. Tra questi, le modifiche post-traduzionali e in particolare l’idrossilazione della prolina, sono di notevole importanza poiché stabilizzano la struttura a tripla elica e sono responsabili della sua funzionalità in vivo. In questo ambito si colloca il presenta lavoro di tesi, il cui scopo è la messa a punto di metodi analitici basati sulle principali modalità cromatografiche, accoppiate alla spettrometria di massa, per lo studio della presenza di prolina idrossilata (Hyp) e la determinazione del grado di idrossilazione in campioni di collagene umano ottenuti per via fermentativa. La via fermentativa richiede l’espressione congiunta della catena del collagene e dell’enzima prolil-4-idrossilasi (P4H), responsabile della sua idrossilazione. Attraverso un approccio diretto e la messa a punto di un saggio enzimatico è stata valutata l’attività dell’enzima nel brodo di coltura, mentre attraverso un approccio indiretto, basato sull’idrolisi acida del collagene e successivo labelling degli amminoacidi, è stata valutata la presenza di Hyp nel costrutto proteico. Entrambi gli approcci si sono rivelati utili e informativi. Lo studio del costrutto proteico ha permesso di valutare con successo la presenza di Hyp nel prodotto ottenuto per via fermentativa, e di stimare semi-quantitativamente il grado di idrossilazione del campione ricombinante rispetto allo standard ottenuto per via estrattiva. Nello studio diretto dell’attività della P4H, i metodi e le tecniche utilizzate hanno permesso di individuare un ceppo produttore dell’enzima attivo che potrà essere utilizzato a livello industriale e ha inoltre permesso di raggiungere una maggiore comprensione circa i requisiti strutturali dell’enzima che ne garantiscono l’attività catalitica.