TAs are a class of enzymes that catalyze the transfer of an amino group to an amino acceptor, which converts the prochiral precursor (ketones or aldehydes) to amines, ubiquitous motif in many drugs. The use of these enzymes for the synthesis of chiral amines has several advantages: excellent stereoselectivity, mild conditions that avoid toxic reagents and reduced waste but their applications has been mostly in one-step reactions, with the example of Merck-Codexis in the evolution of a TA (ATA 117) for its incorporation in the industrial synthesis of sitagliptin. TAs can be used also into enzymatic cascades which not only simplifies the product purification, but also allows the amination of substrates with unfavorable equilibria. For instance, by combining the TA with an ADH, amine can be prepared from simple alcohols in linear cascades. Here, to improve a one pot 2-steps cascade previously described in literature a library of fifteen HSDHs was screened looking for a suitable enzyme able to selectively reduce the 1-keto of 1,2- PPDO to phenyl acetylcarbinol (PAC), the intermediate of interest in the synthesis of ephedrine derivatives, with high stereoselectivity. The two step cascade to synthetize nor(pseudo)ephedrine was performed using Dm7αHSDH. Preliminary results show that this cascade is feasible and best conversions were obtained with Dm7αHSDH and Vf ATA or At ATA.
La ricerca descritta in questa Tesi è stata svolta presso l’“Istituto di Scienze e Tecnologie Chimiche (SCITEC)” del CNR (Milano) in collaborazione con il “Laboratorio di Biocatalisi” dell'Università di Pavia. L’obiettivo della Tesi è la produzione e caratterizzazione di transaminasi (ATA) e idrossisteroide deidrogenasi (HSDH) per applicazioni biocatalitiche. Le ATA sono transferasi PLP-dipendenti che catalizzano il trasferimento di un gruppo amminico su precursori prochirali (chetoni o aldeidi) generando ammine chirali. Le HSDH sono ossidoreduttasi NAD(P)H-dipendenti che catalizzano, in modo reversibile, la conversione di gruppi ossidrilici in gruppi carbonilici negli acidi biliari e negli steroidi. Le HSDH sono enzimi altamente regio- e stereoselettivi. L’interesse applicativo delle HSDH deriva dalla loro attività anche verso substrati non steroidei, come α-chetoesteri e chetoni biciclici. La prima parte della Tesi è stata focalizzata su tre ATA: Ms-ATA1 e Ms-ATA2 da Meiothermus sp., e B3-ATA derivante da un batterio non coltivabile. Lo scopo del lavoro è stato ottimizzare le condizioni di espressione di Ms-ATA1 e B3-ATA e caratterizzare Ms-ATA2 dal punto di vista biochimico. Per quanto riguarda l'ottimizzazione delle condizioni di espressione di Ms-ATA1 e B3-ATA, sono stati utilizzate diverse strategie: mutagenesi, espressione delle proteine fuse con SUMO (una piccola proteina che può migliorare l'espressione e la solubilità di proteine altrimenti poco espresse o insolubili) e la coespressione con chaperonine. Nella seconda parte della Tesi è stata descritta la sintesi di nor(pseudo)efedrine mediante una reazione bi-enzimatica catalizzata da HSDH promiscue e ATA (S)-selettive o (R)-selettive a partire da 1-fenilpropano-1,2-dione (1,2-PPDO). Le nor(pseudo)efedrine sono utilizzate come principi attivi farmaceutici, ma sono anche preziosi building block chirali. Una libreria di quindici HSDH è stata sottoposta a screening per individuare enzimi in grado di ridurre, con elevate regio- e stereoselettività, il gruppo 1-cheto dell'1,2-PPDO a fenilacetilcarbinolo (PAC), l'intermedio della sintesi dei derivati dell'efedrina. L'enzima Dm7α-HSDH (da Deinococcus marmoris) ha catalizzato la riduzione di 1,2-PPDO con elevata regioselettività, ma con scarsa stereoselettività. La riduzione enzimatica è stata comunque effettuata su scala preparativa e il prodotto è stato sottoposto alla reazione di transaminazione. Questa biotrasformazione rappresenta il punto di partenza per lo sviluppo di una biotrasformazione preparativa per la sintesi di efedrine basata su una cascata bi-enzimatica. È attualmente in corso presso SCITEC-CNR lo screening di alcol deidrogenasi in grado di ridurre 1,2-PPDO con elevate regio- e stereoselettività.
Espressione in E. coli di transaminasi e loro applicazione nella sintesi di derivati dell'efedrina.
GRECO, ERIKA
2021/2022
Abstract
TAs are a class of enzymes that catalyze the transfer of an amino group to an amino acceptor, which converts the prochiral precursor (ketones or aldehydes) to amines, ubiquitous motif in many drugs. The use of these enzymes for the synthesis of chiral amines has several advantages: excellent stereoselectivity, mild conditions that avoid toxic reagents and reduced waste but their applications has been mostly in one-step reactions, with the example of Merck-Codexis in the evolution of a TA (ATA 117) for its incorporation in the industrial synthesis of sitagliptin. TAs can be used also into enzymatic cascades which not only simplifies the product purification, but also allows the amination of substrates with unfavorable equilibria. For instance, by combining the TA with an ADH, amine can be prepared from simple alcohols in linear cascades. Here, to improve a one pot 2-steps cascade previously described in literature a library of fifteen HSDHs was screened looking for a suitable enzyme able to selectively reduce the 1-keto of 1,2- PPDO to phenyl acetylcarbinol (PAC), the intermediate of interest in the synthesis of ephedrine derivatives, with high stereoselectivity. The two step cascade to synthetize nor(pseudo)ephedrine was performed using Dm7αHSDH. Preliminary results show that this cascade is feasible and best conversions were obtained with Dm7αHSDH and Vf ATA or At ATA.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/15760