Analisi del ruolo delle risposte al danno del DNA nella terapia genica basata su AAV in termini di attivazione della risposta immunitaria innata e restrizione virale in cellule del sistema nervoso centrale

The gene therapy technology to treat human diseases has already seen the commercialization of various successful products and preclinical studies are continually yielding enhanced technologies. The use of viral vectors as carriers for the therapeutic genes dominates the field and, in particular, AAV vectors are well established in clinical trials for in vivo gene therapy. Despite this, there are still challenges and impediments to be overcome to make the therapeutic gene expression safer and more durable, including viral restriction and immune responses against the vector. Adaptive immune responses against AAVs have been investigated since the first clinical trials and some strategies to evade them have been developed. Instead, the involvement of innate immune sensing has been poorly investigated to this date. Importantly, our lab has previously shown that retroviral and lentiviral (LV) vectors activate type I interferon (IFN) and DNA-damage responses (DDR) respectively in hematopoietic stem cells (HSPCs), and that DDR is induced also by AAV. Nevertheless, the impact of these pathways on cell toxicity and AAV transduction efficacy are still unclear. Because of recent studies showing the induction of severe neurotoxicity due to a high dose systemic AAV administration, which has been demonstrated to be independent of adaptive immune mechanisms, we hypothesized that the activation of the DNA damage response could be involved in the observed neurotoxicity. To test this, we investigated activation of these pathways in the context of Hela and microglia-like HMC3 cell lines. In addition, we also investigated whether the DDR and IFN responses influence AAV transduction efficiency in vitro. Finally, given previous work showing the upregulation of the unfolded protein response (UPR) upon AAV transduction, we performed preliminary experiments to assess the involvement of the UPR in the aforementioned toxicity. Altogether, our results indicate that while AAV trigger DDR in microglia-like cell lines , the inflammation, apoptosis and IFN responses induced by AAV are not p53-dependent. Moreover, we have shown that although the ATM kinase plays a role in the transgene expression, the effect of ATM is also independent of p53 . Finally, we confirmed that the type I IFN responses negatively impact AAV transduction, while the impact of UPR induction seems less relevant although further investigations will be required to better address this aspect. Overall, these studies shed light on the signalling and functional consequences associated with AAV transduction, paving the way for the development of safer and more efficacious gene therapy strategies.

La tecnologia della terapia genica volta al trattamento delle malattie umane ha già visto la commercializzazione di diversi prodotti di successo e gli studi preclinici forniscono continuamente strategie avanzate. L'uso di vettori virali per il trasporto dei geni terapeutici domina il campo e, in particolare, i vettori virali adeno-associati (AAV) sono largamente utilizzati negli studi clinici per la terapia genica in vivo. Nonostante ciò, alcune sfide e impedimenti sono tutt’ora da superare al fine di rendere l'espressione del gene terapeutico più sicura e duratura, tra cui la restrizione virale e le risposte immunitarie contro il vettore. Le risposte immunitarie adattative contro gli AAV sono state indagate sin dai primi studi clinici e alcune strategie per eluderle sono già disponibili, mentre il coinvolgimento del sensing immunitario innato è stato scarsamente studiato fino ad oggi. È importante sottolineare che il nostro laboratorio ha precedentemente dimostrato che i vettori retrovirali e lentivirali (LV) attivano rispettivamente l'interferone di tipo I (IFN) e le risposte al danno del DNA (DDR) nelle cellule staminali ematopoietiche (HSPC) e che la DDR è indotta anche dagli AAV. Tuttavia, l'impatto di questi pathway sulla tossicità cellulare e sull'efficacia della trasduzione di AAV non è ancora chiaro. Dati recenti studi che mostrano l'induzione di grave neurotossicità dovuta a una somministrazione sistemica di AAV ad alte dosi, che si è dimostrata indipendente dai meccanismi immunitari adattativi, abbiamo ipotizzato che l'attivazione della risposta al danno del DNA potesse essere coinvolta nella neurotossicità osservata. Per verificarlo, abbiamo studiato l'attivazione di questi pathway nelle linee cellulari HMC3 e HeLa. Abbiamo inoltre voluto chiarire se DDR e risposta mediata da interferone influenzassero l'efficienza di trasduzione di AAV in vitro. Infine, dato un lavoro precedente che mostrava un’attivazione significativa della unfolded protein response (UPR) in seguito alla trasduzione con AAV, abbiamo eseguito esperimenti preliminari per valutare il coinvolgimento dell'UPR nella suddetta tossicità. Complessivamente, i nostri risultati indicano che nonostante AAV attivi la DDR nelle cellule HMC3, l'infiammazione, l'apoptosi e le risposte indotte da interferone non dipendono da p53. Inoltre, abbiamo dimostrato che sebbene la chinasi ATM svolga un ruolo nell'espressione del transgene, anche l'effetto di ATM è indipendente da p53. Infine, abbiamo confermato che le risposte mediate da IFN di tipo I hanno un impatto negativo sulla trasduzione AAV, mentre l'impatto dell'induzione UPR sembra meno rilevante sebbene saranno necessarie ulteriori indagini per affrontare meglio questo aspetto. Nel complesso, questi studi fanno luce sulla segnalazione e sulle conseguenze funzionali associate alla trasduzione di AAV, aprendo la strada allo sviluppo di strategie di terapia genica più sicure ed efficaci.