Sviluppo e validazione analitica di un saggio NAAT (Nucleic Acid Amplification Test) per la rilevazione rapida di Mycobacterium tuberculosis complex e delle mutazioni genetiche associate alla resistenza agli antibiotici rifampicina e isoniazide.

Secondo i dati dell'OMS, nel 2021 sono morte di tubercolosi (TB) un totale di 1.6 milioni di persone, mentre circa 10 milioni di persone hanno sviluppato una malattia tubercolare attiva a causa dell'infezione da Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC). Inoltre, la TB resistente ai farmaci continua a rappresentare una minaccia per la salute pubblica. La resistenza all'isoniazide (INH) e alla rifampicina (RIF) – i due farmaci di prima linea più efficaci – è di grande preoccupazione. La resistenza a entrambi i farmaci è definita come TB multiresistente (MDR-TB) e richiede un trattamento con farmaci di seconda linea. Nel 2021, quasi mezzo milione di persone ha sviluppato una TB resistente ai farmaci di prima linea ma la maggior parte di queste persone non ha ricevuto una diagnosi di MDR-TB e di conseguenza non ha ricevuto un trattamento appropriato. La MDR-TB può essere trattata con farmaci di seconda linea, che ora sono disponibili a costi elevati e devono essere somministrati rapidamente. Pertanto, l'applicazione di metodi rapidi e affidabili per rilevare l'infezione da MDR-TB è fortemente incoraggiata per avviare un trattamento appropriato ed efficace, evitando sprechi di tempo e risorse. I metodi di coltura in uso mostrano un'elevata sensibilità e specificità, tuttavia, a causa del lento tasso di crescita dell'MTBC, richiedono fino a diverse settimane per ottenere un risultato. È noto che la resistenza ai farmaci di prima linea è legata a specifiche mutazioni genetiche in MTBC; i più significativi sono katG per la resistenza INH, rpoB per la resistenza RIF e possono essere utilizzati come marcatori specifici del DNA per la determinazione della resistenza a INH-RIF MDR-TB attraverso NAAT (test di amplificazione degli acidi nucleici), come il test Real-Time PCR. L’applicazione di una tecnica di biologia molecolare rende questo rilevamento molto più veloce rispetto ai metodi colturali, consentendo somministrazione anticipata del trattamento, migliore risposta dei pazienti, riduzione della trasmissione e un controllo di sanità pubblica più efficace della TB. In questo lavoro di tesi si è sviluppato e validato analiticamente un saggio Real-Time PCR per la rivelazione dell’agente eziologico della TB, MTBC, e delle mutazioni genetiche associate alla resistenza degli antibiotici di prima linea, RIF e INH. Il saggio sviluppato si basa sulla tecnologia TaqMan e funziona in duplex. Il rilevamento del DNA MTBC e delle mutazioni genetiche avviene attraverso primers e probes specifici per la regione del DNA MTB IS6110 e le regioni del DNA rpoB e katG. Il lavoro è stato svolto presso gli stabilimenti di Lodi dell’azienda Hyris Srl. e sviluppato sul sistema Hyris SistemTM che comprende: Hyris bCUBETM, Hyris 16/36-wells cartridges, Hyris bAPPTM.