Caratterizzazione funzionale di mutazioni causali della ceruloplasmina

Introduzione: La ferroptosi è una forma di morte cellulare non apoptotica, ferro-dipendente causata specie reattive dell’ossigeno (ROS) di natura lipidica. Il metabolismo del ferro svolge un ruolo chiave nella ferroptosi e molteplici sono le proteine coinvolte. Fra le proteine coinvolte c’è la ceruloplasmina (Cp), una ferrossidasi che ha un ruolo essenziale nell’omeostasi del ferro, il cui ruolo è stato recentemente osservato nella ferroptosi. Un deficit di Cp causato da mutazioni genetiche e conseguenti basse o assenti concentrazioni sieriche, può essere la causa di malattie rare come, ad esempio, l’aceruloplasminemia (ACP). L’ACP è una malattia ereditaria a trasmissione autosomica recessiva del metabolismo del ferro. Nei pazienti affetti da ACP, la bassa attività della ferrosidasica provoca un aumento di ferro intracellulare con conseguente sovraccarico tissutale nel pancreas, fegato, cuore e sistema nervoso centrale. I principali gli obiettivi del lavoro sono: - Confrontare gli effetti della ceruloplasmina contenente alcune delle mutazioni osservate nei pazienti con quelli studiati in vitro; - Confermare o escludere l’effetto protettivo della ceruloplasmina nel processo di ferroptosi nelle cellule HepG2. - Materiali e metodi: Come modello in vitro è stata selezionata la linea di epatica HepG2. Tre varianti patogenetiche del gene CP (p.Phe217Ser, p.Cys338Ser e p.Ser622_Gly693delinsrp: CP-mut) sono state introdotte in un plasmide contenente CP Wild Type (WT) tramite mutagenesi sito-diretta. I costrutti così ottenuti sono stati utilizzati per la trasfezione. In primis, è stato effettuato un MTT Assay come saggio di vitalità per valutare gli effetti dell’induttore della ferroptosi (Erastina) sulle cellule trasfettate e su cellule non trasfettate. La misurazione del prodotto secondario di perossidazione lipidica Malondialdeide (MDA) è stata effettuata tramite un metodo colorimetrico utilizzando l’acido tiobarbiturico. I livelli dei ROS lipidici sono stati valutati al microscopio confocale. Tramite Western Blot, sono stati invece quantificati i livelli di Acyl-CoA synthetase long chain family member 4 (ACSL4) e Ceruloplasmina. Tramite qRT-PCR sono stati valutati ACSL4, CP e TFR1. L’attività ferrosidasica viene misurata attraverso un metodo colorimetrico utilizzando il siero dei pazienti. Risultati: A 24 ore l’Erastina modifica la proliferazione cellulare con conseguente aumento dei livelli di MDA. Un’overespressione della Cp, ottenuta trasfettando le cellule epatiche con il plasmide contenente il gene CP, è in grado di ridurre i livelli di tossicità dell’Erastina rispetto alle cellule non trasfettate. Al contrario, questo risultato non si osserva nelle cellule trasfettate con i costrutti CP- mut. Infatti, CP-WT riduce i livelli di MDA rispetto alle condizioni non trasfettate, mentre in CP- mut e nelle condizioni trattate, ma non trasfettate, la concentrazione di MDA aumenta. L’Erastina determina inoltre un aumento nell'espressione di ACSL4 nelle cellule non trattate, ma non in quelle trasfettate con CP-WT, dove l'espressione di ACSL4 rimane ridotta. Tramite qRT-PCR dei geni ferro-correlati si sono osservati livelli up/downregolati di ACSL4, CP e TFR1. Nell'attività ferrossidasica non si alcun cambiamento nel medium, mentre si riscontra una diminuzione nel siero dei pazienti rispetto al wild type. Conclusione: La ceruloplasmina si è confermata possedere un effetto protettivo contro la ferroptosi, solo se la proteina è presente nella forma nativa (WT) e non mutata, ipotizzando così un ruolo in questo processo di morte cellulare. Infine, i risultati suggeriscono che la ferroptosi, tramite sovraccarico di perossidi lipidici, potrebbe essere il meccanismo patogenetico che spiegherebbe il danno cellulare nell’aceruloplasminemia.