Vescicole Extracellulari per la veicolazione di ATP esogeno

One of the strategies under study to increase the success of transplants is to use hypothermic perfusion of the exhaled kidneys, in which the perfusion fluid can be enriched with growth factors, oxygen, etc. In this thesis project, the potential of Extracellular Vesicles (EVs) to be formulated as nanocarriers for the delivery of ATP to be administered to the kidney in hypothermic perfusion was studied. In particular, MSC-EVs isolated from porcine bone marrow were used. EVs have been characterized in terms of size and polydispersion index, Z-potential and morphology trough Dynamic Light Scattering (DLS), Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), Trasmission Electron Microscopy (TEM) and Cryo-Electron Microscopy (Cryo-EM). ATP content has been determined with ATP Assay kit after EVs lysis. Vesicles have been enriched with ATP by the microfluidic technique (NanoAssemblr) to encapsulate ATP inside EVs. The encapsulated ATP was subsequently quantified with the appropriate kit and the percentage of enrichment was determined; also, the ATP release from EVs was evaluated. Similarly, negatively charged liposomes were analysed, to mimic more reproducibly the dimensional, morphological and surface charge characteristics of EVs. They were formulated with 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol) and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) at a ratio of 47.5:47.5:5. Microfluidic was used for liposomes synthesis and encapsulation of ATP within them; characterization, quantification of the encapsulated ATP, and the release study were performed under the same operating conditions. The results obtained were then compared with those obtained from the analysis of the EVs. Preliminary studies of cellular uptake were carried out on renal tubular HK-2 cells with fluorescent liposomes. DLS dimensional analysis of the EVs showed the presence of two heterogeneous populations of vesicles: the most abundant population (%) has the size of 61.9 ± 7.8 nm, and the other of 280.5 ± 34.6 nm. Liposomes have an average size of 196.9 ± 89 nm. Both EVs and liposomes have a negative surface charge (Z-potential) as predicted by their composition: for EVs Z= -44.18 mV, while for liposomes Z= -39.26 mV. The results of ATP quantification show that EVs already have a certain native amount of ATP within them, equal to 26.2 ± 3.45 nmol/ml; ATP enrichment in EVs by the microfluidic method leads to double the ATP concentration in EVs (50.16 ± 20.02 nmol/ml). For liposomes, it has been found that more ATP is encapsulated when encapsulation is done by the direct method (57.8 ± 14.8 nmol/ml) than indirect method (30.9 ± 8.48 nmol/ml). Finally, the study of ATP release from liposomes showed that ATP is fully released after 4 h, both at 4° C and 37° C. Vesicles fully release exogenous ATP in the first hour at 4° C and 37° C, after which they quit native ATP releasing. The amount of ATP left in EVs is roughly equal to the amount of ATP present in EVs before encapsulation. Further studies are needed to clarify why native ATP is not released by EVs.

Una delle strategie in studio per aumentare il successo dei trapianti è quella di utilizzare la perfusione ipotermica dei reni espiantati, in cui il liquido di perfusione può essere arricchito di fattori di crescita, ossigeno ecc. In questo progetto di tesi, vengono studiate le potenzialità delle Vescicole Extracellulari (EVs) di agire come nanocarrier per la veicolazione di ATP da somministrare al rene in perfusione ipotermica. In particolare, sono state utilizzate MSC-EVs isolate da midollo osseo porcino. Le EVs sono state caratterizzate in termini di dimensioni e indice di polidispersione, Z-potential e morfologia mediante Dynamic Light Scattering (DLS), Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), Trasmission Electron Microscopy (TEM) e Cryo-Electron Microscopy (Cryo-EM); il contenuto in ATP è stato determinato con ATP Assay kit previa lisi delle EVs. Le vescicole sono state arricchite di ATP mediante la tecnica microfluidica (NanoAssemblr) per incapsulare ATP all’interno delle EVs; l’ATP incapsulato è stato successivamente quantificato con l’apposito kit e ne è stata determinata la percentuale di arricchimento e la cinetica di rilascio. Allo stesso modo sono stati analizzati liposomi carichi negativamente formulati con 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), colesterolo (Chol) e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (DOPS) in rapporto di 47,5:47,5:5, per mimare in maniera più riproducibile le caratteristiche dimensionali, morfologiche e di carica superficiale delle EVs. La microfluidica è stata utilizzata per la sintesi dei liposomi e per l’incapsulazione di ATP al loro interno; la caratterizzazione, la quantificazione di ATP incapsulato e lo studio della cinetica di rilascio sono state eseguite nelle stesse condizioni operative. I risultati ottenuti sono stati quindi confrontati con quelli ottenuti dall’analisi delle EVs. Studi preliminari di uptake cellulare sono stati effettuati su cellule tubulari renali HK2 con liposomi fluorescenti. L’analisi dimensionale al DLS delle EVs ha evidenziato la presenza di due popolazioni eterogenee di vescicole: la popolazione più abbondante (%) presenta delle dimensioni di 61.9 ± 7.8 nm, e l’altra di 280.5 ± 34.6 nm. I liposomi invece hanno delle dimensioni medie di 196.9 ± 89 nm. Sia EVs che liposomi hanno una carica superficiale (Z-potential) negativa, come previsto dalla loro composizione: per le EVs Z= -44.18 mV, mentre per i liposomi Z= -39.26 mV. Dai risultati della quantificazione di ATP si evince che le EVs presentano già al loro interno una certa quantità di ATP, pari a 26.2 ± 3.45 nmol/mL, in linea con i dati da letteratura; l’incapsulazione di ATP nelle EVs con il metodo della microfluidica porta ad una concentrazione di ATP nelle EVs pari a 50,16±20.02 nmol/mL. Per quanto riguarda i liposomi, è stato visto che viene incapsulata una maggiore quantità di ATP quando l’incapsulazione viene effettuata con il metodo diretto (57.8 ± 14.8 nmol/mL) rispetto al metodo indiretto (30.9 ± 8.48 nmol/mL), motivo per cui nei futuri studi verrà utilizzato questo metodo. Infine, lo studio della cinetica di rilascio dell’ATP dai liposomi ha mostrato come l’ATP venga rilasciato completamente dopo 4 h, sia a 4°C che a 37°C. Le vescicole invece rilasciano completamente l’ATP esogeno già nella prima ora a 4°C e a 37°C, dopodiché cessano di rilasciare ATP. La quantità di ATP rimasta nelle EVs è pari all’incirca alla quantità di ATP presente nelle EVs prima dell’incapsulazione. Ulteriori studi sono necessari per chiarire il motivo per cui l’ATP intrinseco non venga rilasciato dalle EVs.