Regenerative medicine (RG) aims to replace tissue or organs that have been damaged. Tissue engineering, exploiting the use of scaffolds, cells and active molecules, has the main purpose of recreating functional tissues in order to ensure regeneration. Scaffold composition, morphology and architecture must guarantee suitable cell adhesion, proliferation and, in case, optimal drug release to ensure tissue integration and fast regeneration. Among all the scaffold manufacturing techniques, electrospinning has demonstrated excellent manufacturing capabilities. The electrospun scaffolds are easily reproducible, with an internal nano-structure capable of mimicking that of the native extracellular matrix and good drug delivery capabilities. In this thesis, Dexamethasone (DXM), a steroidal anti-inflammatory drug with active role in cell’s proliferation and differentiation, was incorporate into biodegradable polymer scaffolds made by Electrospinning technique. Co-polymer Poly-L-lactide- co – poly- caprolactone (PLA: PCL 70:30) was used for scaffolds manufacturing due to its biocompatibility and biodegradability. Scaffolds obtained were characterized for their morphology, wettability, mechanical properties, drug content, dexamethasone release rate and kinetic. First of all, biological studies were conducted using human normal dermal fibroblasts (HNDF) to assess the role of the drug in cell viability and proliferation. Moreover, electrospun scaffolds loaded with DXM, were combined with PLA-PCL (70:30) 3D-printed scaffolds (infill 20% and 50%) to obtain hybrid scaffolds for testing influence on cells growth and proliferation. Electrospun scaffolds obtained showed fibers dimension in a nanometer size range ( 700nm) and a good DXM encapsulation efficiency (> 80%). Wettability and mechanical strength do not decrease significantly in DXM-loaded scaffolds, indicating that the presence of the drug influences the fiber properties. Compared to free drug, the fibers are able to slow down the drug release rate up to 24h in the case of electrospun scaffolds and up to 48h for hybrid scaffolds (electrospinning + 3D). Cell viability demonstrated that DXM-carrying scaffolds (final concentration 0.0125mg/mL) have a higher viability value (>200%) than placebo scaffolds (100%). A preliminary study was also performed on porcine mesenchymal stem cells (p-MSCs) to evaluate their ability to differentiate into cells of the myogenic lineage induced by DXM. MyoD marker was selected to identify myoblast differentiation. After 6 week incubation period, a MSC differentiation in myocytes was highlighted through fluorescent microscopy technique. Further studies will be performed to evaluate also influence of DXM loaded electrospun fibers on myogenic differentiation.
La medicina rigenerativa (RG) mira a sostituire tessuti o organi danneggiati da malattie, traumi o a causa di difetti congeniti o di invecchiamento. L'ingegneria tissutale, sfruttando l'uso di scaffolds, cellule e molecole con un’attività farmacologica, ha il principale scopo di ricreare tessuti funzionali al fine di garantire la rigenerazione. La composizione, la morfologia e l'architettura dello scaffold devono garantire un’adeguata adesione cellulare, proliferazione ed eventualmente un ottimale rilascio di farmaco in modo da portare ad una integrazione dei tessuti ed una rapida rigenerazione. Tra tutte le tecniche di produzione dello scaffold, l'elettrofilatura risulta quella che ha dimostrato i risultati ottimali con un’ottima capacità di produzione. Gli scaffolds, prodotti tramite questa tecnica, sono facilmente riproducibili ed hanno buone capacità di rilascio del farmaco ed una nanostruttura interna in grado di mimare quella della matrice extracellulare nativa. In questa tesi, il desametasone (DXM), un farmaco antinfiammatorio steroideo con un ruolo attivo nella proliferazione e differenziazione cellulare, è stato incorporato in scaffolds polimerici biodegradabili realizzati mediante la tecnica dell'elettrofilatura. Per la produzione di scaffold è stato utilizzato il copolimero costituito da acido poli lattico (PLA) e policaprolattone (PCL) in rapporto 70:30. Gli scaffolds ottenuti sono stati caratterizzati in base alla loro morfologia, bagnabilità, proprietà meccaniche, contenuto di farmaco, velocità e cinetica di rilascio del desametasone. Inizialmente, sono stati condotti studi biologici utilizzando fibroblasti dermici umani (HNDF) per valutare il ruolo del farmaco nella vitalità e proliferazione cellulare. Inoltre, le soluzioni polimeriche placebo e quelle contenenti DXM sono state utilizzate per la formazione di scaffold ibridi formati tramite la tecnica di elettrofilatura avvenuta su stampe 3D (con riempimento al 20% e 50%). Gli scaffolds ottenuti hanno mostrato dimensioni delle fibre nell'ordine dei nanometri (≈ 700 nm) e un'efficienza di incapsulamento di DXM elevata (> 80%). La bagnabilità e la resistenza meccanica non diminuiscono significativamente negli scaffold caricati con DXM, indicando che la presenza del farmaco influisce sulle proprietà delle fibre. Inoltre, rispetto al farmaco libero, le fibre sono in grado di rallentare la velocità di rilascio del farmaco fino a 24 ore nel caso di scaffold elettrofilati e fino a 48 ore nel caso di scaffold ibridi (elettrofilatura + 3D). In termini di vitalità cellulare è stato dimostrato che scaffold contenenti DXM (concentrazione finale 0,0125 mg/mL) presentano un valore di vitalità superiore (> 200%) rispetto a quelli di controllo (≈ 100%). È stato infine condotto uno studio preliminare sulle cellule staminali mesenchimali suine (p-MSC) per valutare la loro capacità di differenziarsi in cellule miogeniche indotto da DXM, tramite l’utilizzo del marcatore MyoD. Dopo un periodo di incubazione di 6 settimane, è stata evidenziata una differenziazione delle MSC in miociti attraverso la tecnica di microscopia a fluorescenza. In futuro, ulteriori studi saranno condotti per valutare anche l'influenza delle fibre elettrofilate caricate con DXM sulla differenziazione miogenica.
Studio preliminare di electrospinning e 3D printing abbinati nella produzione di scaffolds contenenti DXM per rigenerazione tissutale
LORINO, MARTA
2022/2023
Abstract
Regenerative medicine (RG) aims to replace tissue or organs that have been damaged. Tissue engineering, exploiting the use of scaffolds, cells and active molecules, has the main purpose of recreating functional tissues in order to ensure regeneration. Scaffold composition, morphology and architecture must guarantee suitable cell adhesion, proliferation and, in case, optimal drug release to ensure tissue integration and fast regeneration. Among all the scaffold manufacturing techniques, electrospinning has demonstrated excellent manufacturing capabilities. The electrospun scaffolds are easily reproducible, with an internal nano-structure capable of mimicking that of the native extracellular matrix and good drug delivery capabilities. In this thesis, Dexamethasone (DXM), a steroidal anti-inflammatory drug with active role in cell’s proliferation and differentiation, was incorporate into biodegradable polymer scaffolds made by Electrospinning technique. Co-polymer Poly-L-lactide- co – poly- caprolactone (PLA: PCL 70:30) was used for scaffolds manufacturing due to its biocompatibility and biodegradability. Scaffolds obtained were characterized for their morphology, wettability, mechanical properties, drug content, dexamethasone release rate and kinetic. First of all, biological studies were conducted using human normal dermal fibroblasts (HNDF) to assess the role of the drug in cell viability and proliferation. Moreover, electrospun scaffolds loaded with DXM, were combined with PLA-PCL (70:30) 3D-printed scaffolds (infill 20% and 50%) to obtain hybrid scaffolds for testing influence on cells growth and proliferation. Electrospun scaffolds obtained showed fibers dimension in a nanometer size range ( 700nm) and a good DXM encapsulation efficiency (> 80%). Wettability and mechanical strength do not decrease significantly in DXM-loaded scaffolds, indicating that the presence of the drug influences the fiber properties. Compared to free drug, the fibers are able to slow down the drug release rate up to 24h in the case of electrospun scaffolds and up to 48h for hybrid scaffolds (electrospinning + 3D). Cell viability demonstrated that DXM-carrying scaffolds (final concentration 0.0125mg/mL) have a higher viability value (>200%) than placebo scaffolds (100%). A preliminary study was also performed on porcine mesenchymal stem cells (p-MSCs) to evaluate their ability to differentiate into cells of the myogenic lineage induced by DXM. MyoD marker was selected to identify myoblast differentiation. After 6 week incubation period, a MSC differentiation in myocytes was highlighted through fluorescent microscopy technique. Further studies will be performed to evaluate also influence of DXM loaded electrospun fibers on myogenic differentiation.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/16086