Modelli in vitro per la sindrome di Joubert: validazione di un protocollo di differenziamento neuro-cerebellare e sviluppo di nuove linee iPSCs da pazienti con mutazioni nel gene RPGRIP1L.

La sindrome di Joubert (JS) è una ciliopatia rara con ereditarietà autosomica recessiva o legata al cromosoma X. Il segno distintivo è il “segno del dente molare” (MTS), malformazione cerebellare e del tronco encefalico rilevabile tramite risonanza magnetica, ma è una patologia che può coinvolgere anche manifestazioni in altri organi. È una sindrome causata da un malfunzionamento del cilio primario, organello sensoriale presente in molti tipi cellulari all’interno dell’organismo. Le mutazioni nei geni causativi della JS possono causare problematiche sia nella struttura sia nel funzionamento delle cilia. Tra i geni identificati come mutati nei pazienti JS, il gene RPGRIP1L, è localizzato nel corpo basale e zona di transizione del cilio ed è coinvolto nel suo assemblaggio. In pazienti con JS sono state identificate mutazioni sia omozigoti sia eterozigoti del gene preso in esame che sono correlate al sottogruppo di manifestazioni cerebello-renali. Al fine di analizzare i difetti cellulari alla base del fenotipo dei pazienti JS, questo progetto ha studiato le cellule pluripotenti indotte (iPSCs) per: (i) stabilire un modello in vitro di differenziamento verso i tipi cellulari cerebellari umani, (ii) sviluppare delle cellule iPSCs derivate da due pazienti con mutazioni nel gene RPGRIP1L, insieme a delle cellule iPSCs derivate da controllo sano. Nella prima parte del progetto, è stato analizzato un protocollo di differenziamento a partire da cellule iPSC umane, usate per produrre cellule staminali neurali (NSCs) poi trattate con fattori di differenziamento favorendo la produzione di neuroni cerebellari. La seconda parte si è concentrata su due nuove linee iPSCs prodotte da pazienti con mutazioni nel gene RPGRIP1L. Tramite RT-qPCR e studi di immunoistochimica è stato verificato che queste linee riprogrammate esprimessero i marcatori di staminalità e fossero pluripotenti, quindi che potessero dar origine ai tre foglietti embrionali (endoderma, mesoderma ed ectoderma). Tutti i dati ottenuti da queste linee cellulari derivate da pazienti sono stati poi confrontati con i risultati ottenuti da una linea controllo derivata da soggetti sani. Non sono state riportate differenze significative tra le linee iPSCs dei pazienti e dei controlli, ad eccezione dell’espressione di SOX2 tra le linee pazienti e controllo. In seguito, le iPSCs generate sono state differenziate in cellule staminali neurali (NSCs), dimostrandosi in grado di esprimere i marcatori specifici per questa tipologia cellulare, sia in studi di RT-qPCR sia di immunoistochimica, e quindi adatte ad essere utilizzate per il protocollo di differenziamento cerebellare ottimizzato all’inizio del progetto. I dati ottenuti dalle NSCs non hanno evidenziato una sostanziale differenza tra le linee JS e la linea di controllo, sia nella capacità differenziativa delle iPSCs ad NSCs sia nell’espressione genica dei marcatori di staminalità, ad eccezione della linea cellulare NG2266 (RPGRIP1L) che in alcuni studi di immunofluorescenza ha presentato una percentuale minore di cellule positive ai marcatori nucleari testati. Avendo stabilito la validità del protocollo di differenziamento cerebellare sulla linea controllo, e verificato l’idoneità delle linee ottenute dai pazienti con mutazioni RPGRIP1L, il progetto rende possibile la fase successiva, cioè l’induzione del differenziamento cerebellare in parallelo per linee mutate e di controllo, per analizzare il fenotipo legato a mutazioni RPGRIP1L. Infatti, la produzione di tali modelli JS in vitro rappresenta un passo importante per ricercare le basi molecolari e la patogenesi della sindrome, per poi in un futuro sviluppare terapie mirate per i pazienti presentanti la JS.