Decoding the puzzle of the Coenzyme Q metabolon: biochemical and functional characterization of four ancestral COQ proteins

Coenzyme Q is synthesized by a biochemically active metabolon consisting of a benzoquinone head group attached to a hydrophobic tail, present in the mitochondrial electron transport chain, and requires at least 10-11 proteins encoded by the COQ genes for its biosynthesis. The term ‘metabolon’ refers to a multiprotein complex or assembly of enzymes that work together in a coordinated manner to carry out specific metabolic pathways. Identifying all the structures of the various proteins present in the mitochondria and understanding their integration into signaling pathways have major challenges in cell biology as the structure of the whole complex is still uncertain. Additionally, further research is needed to determine the stability of each protein in the complex.Human proteins of the COQ metabolon are still not identified in vitro but Ancestral sequence reconstruction helps to characterize the different proteins without disturbing their enzymatic activity and providing increased thermostability. To address those shortcomings, structural, functional characterization, and enzymatic kinetics of COQ3, COQ4, COQ7, COQ9 is analyzed here. We have shown that the catalytic effectiveness of COQ3 depends on the presence of divalent cations, specifically magnesium. We demonstrated that COQ9 improves the enzymatic activity of COQ7, using NADH as reducing equivalents donor. Since mono-prenylation provided a higher kinetic rate, this suggests that the attached carbon chain gives COQ7 its higher activity. A qualitative study is performed by simulating the coupling of COQ3 and COQ7 in coenzyme Q biosynthesis. By using this approach, we detected the presence of the desired products in the biosynthesis. Here we report that the enigmatic decarboxylation reaction present during Coenzyme Q biosynthesis is performed by COQ4. In this instance, we demonstrated that ancestral COQ4 contained a Zn-binding site as predicted by the human AlphaFold model. In order to validate the presence of the Zn binding site, COQ4 Zn binding deficient mutants were generated at desired sites. These mutations verify the requirement of Zn for decarboxylation, which was then validated by thermo-stability studies and UHPLC/HRMS analyses. The primary contributions of our research were characterized as the expression of proteins and discovery of the activity of the AncCOQ enzyme. From this point on, structural studies employing samples that have been improved for protein quality are essential to define the metabolon's architecture. Understanding the structure and dynamics of the Coenzyme Q complex metabolon can provide insights into cellular bioenergetics and potential targets for therapeutic interventions in energy-related disorders.

Decifrare il puzzle del metabolone del Coenzima Q: caratterizzazione biochimica e funzionale di quattro proteine COQ ancestrali. Il Coenzima Q è sintetizzato da un complesso multienzimatico (metabolone) e consiste di una testa benzochinonica attaccata ad una coda idrofobica. È coinvolto nella catena di trasporto degli elettroni nel mitocondrio e richiede almeno 10-11 proteine, codificate dai geni COQ, per essere prodotto. Il termine “metabolone” si riferisce a un complesso multiproteico o ad un insieme di enzimi che lavorano in modo concertato e in prossimità spaziale così da svolgere efficientemente un dato pathway metabolico. Identificare le strutture tridimensionali delle varie proteine del metabolone presenti nel mitocondrio e comprendere la loro integrazioni in sistemi di segnalazione, rappresentano una grande sfida per la biologia in quanto la struttura dell’intero complesso rimane incerta. In particolar modo, ulteriore ricerca è necessaria per determinare la stabilità di ciascuna proteina nel complesso. Le proteine del metabolone COQ umano non sono state ad oggi completamente caratterizzate in vitro, ma la ricostruzione delle sequenze ancestrali ha permesso di caratterizzarle grazie ad un aumento nella loro stabilità termodinamica senza andarne a variare le attività enzimatiche. Per iniziare a risolvere le questioni ora proposte una caratterizzazione biochimica e funzionale, nonché cinetiche enzimatiche, delle proteine COQ3, COQ4, COQ7 e COQ9 è oggetto di questo lavoro di tesi. Abbiamo dimostrato che l’efficienza catalitica di COQ3 dipende dalla presenza di ioni divalenti, nello specifico magnesio. Abbiamo dimostrato che COQ9 aumenta l’attività enzimatica di COQ7, utilizzato NADH come donatore di equivalenti riducenti. Inoltre, dato che la mono-prenilazione del substrato risulta in una maggiore attività di COQ7, abbiamo verificato che la coda idrofobica è coinvolta nel riconoscimento del substrato. Inoltre, uno studio qualitativo è stato effettuato accoppiando le attività di COQ7 e COQ3 per verificare l’accoppiamento di enzimi nella produzione di Coenzima Q. Applicando questo approccio abbiamo individuato con successo i prodotti biosintetici attesi. In questa tesi riportiamo che la reazione di decarbossilazione presente nella biosintesi del Coenzima Q, precedentemente non attribuita, è svolta da COQ4. Abbiamo dimostrato che COQ4 presenta un sito di legame per ioni zinco come predetto dal modello strutturale di AlphaFold. Al fine di validare il ruolo catalitico dello zinco, dei mutanti sono stati generati a livello del sito di legame. Queste mutazioni hanno permesso di verificare che la presenza di zinco è fondamentale per la reazione di decarbossilazione. Ciò è stato validato da analisi di termostabilità e analisi in UHPLC/HRMS Il contributo principale della nostra ricerca è stato riuscire ad esprimere e caratterizzare l’attività di alcune proteine COQ. Su queste basi, futuri studi strutturali su campioni proteici di buona purezza saranno fondamentali per comprendere l’architettura del metabolone. Comprendere la struttura e la dinamica del metabolone COQ può fornire un potenziale target terapeutico.