Espressione di proteine non strutturali di SARS-CoV-2 nel lievito Saccharomyces cerevisiae

Una caratteristica universale dei virus con genoma composto da RNA a filamento positivo è la loro replicazione in costante associazione con le membrane delle cellule ospiti, che proliferano e si modificano dando origine a invaginazioni di membrana, vescicole a singola o doppia membrana, pacchetti di vescicole legati alla membrana stessa e altre strutture. Tale fenomeno può coinvolgere tutte le membrane nelle cellule infettate. La replicazione del virus umano SARS-CoV-2 avviene in vescicole a doppia membrana (DMV) derivate dal riarrangiamento della membrana del reticolo endoplasmatico della cellula ospite. Un ruolo centrale in questo processo è ricoperto dalle proteine non strutturali di SARS-CoV-2 nsp3, nsp4 e nsp6 che determinano la formazione, l’accoppiamento e l’organizzazione delle DMV. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di mettere a punto un sistema efficiente e stabile per l’espressione in lievito di proteine non strutturali (nsp3, nsp4 e nsp6) del virus SARS-CoV-2, con genoma a RNA positivo, ai fini di studiarne i meccanismi patogenetici e il ruolo del ER in tali processi. In primo luogo i plasmidi pDONR207-nsp3, pDONR223-nsp4 e pDONR223-nsp6, contenenti i geni sintetici codificanti le proteine nsp3, nsp4 e nsp6 di SARS-CoV-2, sono stati utilizzati per clonare le sequenze delle ORF di nsp3, nsp4 e nsp6 di SARS-CoV-2, sotto il controllo del promotore inducibile GAL1 nel vettore di espressione pYES-DEST52. Successivamente, non disponendo di un antisiero specifico per ciascuna delle tre proteine, le tre ORF nel vettore pYES-DEST52 sono state mutagenizzate mediante mutagenesi sito diretta per inserire in frame il tag V5 all'estremità carbossi-terminale delle proteine. I plasmidi così ottenuti, contenenti le sequenze codificanti nsp3, nsp4 e nsp6, sono stati utilizzati per trasformare due ceppi di Saccharomyces cerevisiae (YPH499 e W303-1B), per confrontarli e selezionare quello in cui avviene una migliore espressione delle proteine esogene. Per ottenere l’espressione delle proteine, le cellule di lievito sono state coltivate nello stesso mezzo selettivo privo di uracile e contenente galattosio per indurre l'espressione del promotore inducibile GAL1, a due temperature differenti. L’espressione delle tre proteine non strutturali di SARS-CoV-2 in lievito è stata verificata mediante analisi di western blot utilizzando l’anticorpo monoclonale anti-V5. Per determinare l'effetto dell’espressione delle tre proteine, indispensabili per la replicazione virale e di cui è nota l’associazione al ER, sono state analizzate, in funzione del tempo, sia la crescita che la vitalità delle cellule trasformate con i tre plasmidi contenenti nsp3, nsp4 e nsp6 e confrontate con cellule di controllo. È stato osservato che l’espressione ectopica di nsp3, ma soprattutto di nsp4 causano un rallentamento significativo della crescita, se confrontata con la crescita delle cellule che esprimono nsp6 e di quelle di controllo che non esprimono alcuna proteina. L’analisi della vitalità delle cellule che esprimono le tre proteine e dei controlli, analizzata agli stessi tempi della crescita cellulare, ha evidenziato una significativa riduzione della vitalità soltanto nelle cellule che esprimono nsp4 in tutti i punti temporali. Contemporaneamente è stata verificata l’espressione delle proteine virali nelle cellule in coltura mediante elettroforesi di estratti proteici totali seguita da immunoblotting. L’effetto della proteina nsp4 sulla vitalità delle cellule è risultato specifico e variabile in funzione del tempo. Al diminuire della proteina aumenta la vitalità delle cellule, mentre la quantità di proteine totali resta invariata, come dimostrato dall’analisi di Kar2p, una proteina del ER del lievito. I risultati ottenuti hanno mostrato che le tre proteine non strutturali di SARS-CoV-2 oggetto dello studio sono espresse nel lievito in maniera corretta, efficiente e stabile.