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Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia (HHT) is a rare vascular disease with autosomal dominant inheritance, affecting approximately 1 in 5000 individuals. HHT is evaluated using the “Curaçao criteria”, which include the presence of telangiectasias, recurrent epistaxis, visceral arteriovenous malformations (AVMs), and the presence of family cases of the disease. HHT is associated with pathogenic variants in genes involved in the Transforming Growth Factor-β (TGF-β) molecular pathway: ENG, ACVRL1, SMAD4, and GDF2. However, there are other genes, including RASA1, EPHB4, and BMPR2 that, when altered, can cause vascular syndromes that share common symptoms with HHT, and it has been demonstrated that, in patients negative for the four main genes, the causative variant often resides in one of these genes. Whole Genome Sequencing (WGS) has significantly improved the diagnosis rate for individuals suspected of having genetic diseases, as it includes coding and non-coding regions, otherwise excluded from the molecular analyses. Approximately 90% of the mutations responsible for HHT are in the two main genes. However, in about 10% of clinically diagnosed HHT cases, it is not possible to identify a causal variant using standard diagnostic techniques, leading to these patients being classified as “Not Found”. The aim of this project is focused indeed on WGS analyses of these patients to identify new causal variants of HHT located within the non-coding regions of the genome and uncover new molecular mechanisms underlying the disease. I started with WGS data of 10 patients that underwent tertiary bioinformatic analysis, considering a 7 genes virtual panel (ENG, ACVRL1, SMAD4, GDF2, RASA1, EPHB4 and BMPR2), including intronic regions. The variants were filtered considering the allele frequency <1%, based on the gnomAD database, they were searched on prediction tools and classified according to the ACMG/AMP criteria. The candidate variant was subsequently confirmed by Sanger sequencing. A candidate variant was found in 7 out of 10 cases, among which 5 exonic and pathogenic, 2 intronic VUS hot and affecting the splicing. In 2 out of 10 cases intronic VUS cold variants were found and were predicted to affect splicing. Among all these variants, novel pathogenic ones have been identified. In the remaining case it’s necessary to further amplify the genic panel. Interestingly, a variant in EPHB4 gene was found in a clinically diagnosed HHT patient who did not show any candidate variant in the 4 main HHT genes. For this reason, it is important to include other genes involved in clinically (at least partially) overlapping syndromes, eventually followed by a reverse phenotyping, to re-evaluate the patient. The results obtained in this thesis show that approximately 50% of the identified variants are exonic, while the remaining ones are located in intronic regions. These findings underscore the effectiveness of the Whole Genome Sequencing (WGS) approach: the analysis of both coding and non-coding regions can enhance the diagnostic rate of molecular analyses. This approach can contribute to a comprehensive genetic diagnosis for patients clinically affected by HHT, increasing our knowledge about molecular mechanisms underlying HHT, and, therefore, paving the way to novel therapeutic targets.  

Teleangectasia Emorragica Ereditaria: Whole Genome Sequencing nei pazienti "Not Found". La teleangectasia emorragica ereditaria (HHT) è una malattia vascolare rara a trasmissione autosomica dominante, che colpisce circa 1 individuo su 5.000. L'HHT viene valutato utilizzando i “criteri di Curaçao”, che includono la presenza di teleangectasie, epistassi ricorrenti, malformazioni artero-venose viscerali (MAV) e la presenza di casi familiari della malattia. L'HHT è associato a varianti patogeniche nei geni coinvolti nel pathway molecolare del Transforming Growth Factor-β (TGF-β): ENG, ACVRL1, SMAD4 e GDF2. Tuttavia, ci sono altri geni, tra cui RASA1, EPHB4 e BMPR2 che, se alterati, possono causare sindromi vascolari che mostrano sintomi comuni con l’HHT, ed è stato dimostrato che, nei pazienti negativi per i quattro geni principali, la variante causativa spesso risiede in uno di questi geni. Il sequenziamento dell’intero genoma (WGS) ha migliorato significativamente il tasso di diagnosi per gli individui sospettati di avere malattie genetiche, poiché include regioni codificanti e non codificanti, altrimenti escluse dalle analisi molecolari. Circa il 90% delle mutazioni responsabili dell'HHT si trovano nei due geni principali. Tuttavia, in circa il 10% dei casi di HHT diagnosticati clinicamente, non è possibile identificare una variante causativa utilizzando tecniche diagnostiche standard, portando questi pazienti a essere classificati come “Not Found”. Lo scopo di questo progetto si concentra sull’analisi WGS di questi pazienti per identificare nuove varianti causative dell’HHT localizzate all'interno delle regioni non codificanti del genoma e scoprire nuovi meccanismi molecolari alla base della malattia. I dati WGS di 10 pazienti sono stati analizzati e sottoposti ad analisi bioinformatica terziaria, considerando un pannello virtuale di 7 geni (ENG, ACVRL1, SMAD4, GDF2, RASA1, EPHB4 e BMPR2), comprese le regioni introniche. Le varianti sono state filtrate considerando la frequenza allelica <1%, in base al database gnomAD, sono state ricercate su strumenti di previsione e classificate secondo i criteri ACMG/AMP. La variante candidata è stata successivamente confermata dal sequenziamento di Sanger. Una variante candidata è stata trovata in 7 casi su 10, tra cui 5 esoniche e patogeniche e 2 introniche VUS hot e che impattano sullo splicing. In 2 casi su 10 sono state riscontrate varianti introniche VUS cold e si prevedeva che influenzassero lo splicing. Tra le varianti individuate, ne sono state osservate 5 nuove, non presenti nei database o nei dati di letteratura. Nel restante caso è necessario amplificare ulteriormente il pannello genico. Risulta interessante il caso di una paziente diagnosticata clinicamente HHT (4/4 criteri di Curaçao), nella quale, però, non è stata individuata una variante causativa nei 4 geni correlati alla malattia. La paziente, infatti, risulta portatrice di una variante patogenetica nel gene EPHB4, associato ad una sindrome vascolare dalla sintomatologia in parte sovrapponibile con l’HHT. Questo evidenzia l’importanza di includere geni correlati a sindromi vascolari con sintomatologia simile all’HHT. I risultati ottenuti in questa tesi mostrano che circa il 50% delle varianti identificate sono esoniche, mentre le restanti sono localizzate in regioni introniche. Questi risultati sottolineano l’efficacia dell’approccio Whole Genome Sequencing (WGS): l’analisi delle regioni codificanti e non codificanti può aumentare il tasso diagnostico delle analisi molecolari. Questo approccio può contribuire a una diagnosi genetica completa per i pazienti clinicamente affetti da HHT, aumentando la nostra conoscenza sui meccanismi molecolari alla base dell'HHT e, quindi, aprendo la strada a nuovi bersagli terapeutici.

Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia: Whole Genome Sequencing in "Not Found" patients

COFFA, MARTINA
2022/2023

Abstract

Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia (HHT) is a rare vascular disease with autosomal dominant inheritance, affecting approximately 1 in 5000 individuals. HHT is evaluated using the “Curaçao criteria”, which include the presence of telangiectasias, recurrent epistaxis, visceral arteriovenous malformations (AVMs), and the presence of family cases of the disease. HHT is associated with pathogenic variants in genes involved in the Transforming Growth Factor-β (TGF-β) molecular pathway: ENG, ACVRL1, SMAD4, and GDF2. However, there are other genes, including RASA1, EPHB4, and BMPR2 that, when altered, can cause vascular syndromes that share common symptoms with HHT, and it has been demonstrated that, in patients negative for the four main genes, the causative variant often resides in one of these genes. Whole Genome Sequencing (WGS) has significantly improved the diagnosis rate for individuals suspected of having genetic diseases, as it includes coding and non-coding regions, otherwise excluded from the molecular analyses. Approximately 90% of the mutations responsible for HHT are in the two main genes. However, in about 10% of clinically diagnosed HHT cases, it is not possible to identify a causal variant using standard diagnostic techniques, leading to these patients being classified as “Not Found”. The aim of this project is focused indeed on WGS analyses of these patients to identify new causal variants of HHT located within the non-coding regions of the genome and uncover new molecular mechanisms underlying the disease. I started with WGS data of 10 patients that underwent tertiary bioinformatic analysis, considering a 7 genes virtual panel (ENG, ACVRL1, SMAD4, GDF2, RASA1, EPHB4 and BMPR2), including intronic regions. The variants were filtered considering the allele frequency <1%, based on the gnomAD database, they were searched on prediction tools and classified according to the ACMG/AMP criteria. The candidate variant was subsequently confirmed by Sanger sequencing. A candidate variant was found in 7 out of 10 cases, among which 5 exonic and pathogenic, 2 intronic VUS hot and affecting the splicing. In 2 out of 10 cases intronic VUS cold variants were found and were predicted to affect splicing. Among all these variants, novel pathogenic ones have been identified. In the remaining case it’s necessary to further amplify the genic panel. Interestingly, a variant in EPHB4 gene was found in a clinically diagnosed HHT patient who did not show any candidate variant in the 4 main HHT genes. For this reason, it is important to include other genes involved in clinically (at least partially) overlapping syndromes, eventually followed by a reverse phenotyping, to re-evaluate the patient. The results obtained in this thesis show that approximately 50% of the identified variants are exonic, while the remaining ones are located in intronic regions. These findings underscore the effectiveness of the Whole Genome Sequencing (WGS) approach: the analysis of both coding and non-coding regions can enhance the diagnostic rate of molecular analyses. This approach can contribute to a comprehensive genetic diagnosis for patients clinically affected by HHT, increasing our knowledge about molecular mechanisms underlying HHT, and, therefore, paving the way to novel therapeutic targets.  
2022
Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia: Whole Genome Sequencing in "Not Found" patients
Teleangectasia Emorragica Ereditaria: Whole Genome Sequencing nei pazienti "Not Found". La teleangectasia emorragica ereditaria (HHT) è una malattia vascolare rara a trasmissione autosomica dominante, che colpisce circa 1 individuo su 5.000. L'HHT viene valutato utilizzando i “criteri di Curaçao”, che includono la presenza di teleangectasie, epistassi ricorrenti, malformazioni artero-venose viscerali (MAV) e la presenza di casi familiari della malattia. L'HHT è associato a varianti patogeniche nei geni coinvolti nel pathway molecolare del Transforming Growth Factor-β (TGF-β): ENG, ACVRL1, SMAD4 e GDF2. Tuttavia, ci sono altri geni, tra cui RASA1, EPHB4 e BMPR2 che, se alterati, possono causare sindromi vascolari che mostrano sintomi comuni con l’HHT, ed è stato dimostrato che, nei pazienti negativi per i quattro geni principali, la variante causativa spesso risiede in uno di questi geni. Il sequenziamento dell’intero genoma (WGS) ha migliorato significativamente il tasso di diagnosi per gli individui sospettati di avere malattie genetiche, poiché include regioni codificanti e non codificanti, altrimenti escluse dalle analisi molecolari. Circa il 90% delle mutazioni responsabili dell'HHT si trovano nei due geni principali. Tuttavia, in circa il 10% dei casi di HHT diagnosticati clinicamente, non è possibile identificare una variante causativa utilizzando tecniche diagnostiche standard, portando questi pazienti a essere classificati come “Not Found”. Lo scopo di questo progetto si concentra sull’analisi WGS di questi pazienti per identificare nuove varianti causative dell’HHT localizzate all'interno delle regioni non codificanti del genoma e scoprire nuovi meccanismi molecolari alla base della malattia. I dati WGS di 10 pazienti sono stati analizzati e sottoposti ad analisi bioinformatica terziaria, considerando un pannello virtuale di 7 geni (ENG, ACVRL1, SMAD4, GDF2, RASA1, EPHB4 e BMPR2), comprese le regioni introniche. Le varianti sono state filtrate considerando la frequenza allelica <1%, in base al database gnomAD, sono state ricercate su strumenti di previsione e classificate secondo i criteri ACMG/AMP. La variante candidata è stata successivamente confermata dal sequenziamento di Sanger. Una variante candidata è stata trovata in 7 casi su 10, tra cui 5 esoniche e patogeniche e 2 introniche VUS hot e che impattano sullo splicing. In 2 casi su 10 sono state riscontrate varianti introniche VUS cold e si prevedeva che influenzassero lo splicing. Tra le varianti individuate, ne sono state osservate 5 nuove, non presenti nei database o nei dati di letteratura. Nel restante caso è necessario amplificare ulteriormente il pannello genico. Risulta interessante il caso di una paziente diagnosticata clinicamente HHT (4/4 criteri di Curaçao), nella quale, però, non è stata individuata una variante causativa nei 4 geni correlati alla malattia. La paziente, infatti, risulta portatrice di una variante patogenetica nel gene EPHB4, associato ad una sindrome vascolare dalla sintomatologia in parte sovrapponibile con l’HHT. Questo evidenzia l’importanza di includere geni correlati a sindromi vascolari con sintomatologia simile all’HHT. I risultati ottenuti in questa tesi mostrano che circa il 50% delle varianti identificate sono esoniche, mentre le restanti sono localizzate in regioni introniche. Questi risultati sottolineano l’efficacia dell’approccio Whole Genome Sequencing (WGS): l’analisi delle regioni codificanti e non codificanti può aumentare il tasso diagnostico delle analisi molecolari. Questo approccio può contribuire a una diagnosi genetica completa per i pazienti clinicamente affetti da HHT, aumentando la nostra conoscenza sui meccanismi molecolari alla base dell'HHT e, quindi, aprendo la strada a nuovi bersagli terapeutici.
OLIVIERI, CARLA
Lauree Magistrali
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14239/16500