Analisi del secretoma nel modello murino Amish di Osteogenesi Imperfetta

Most cases of dominantly inherited osteogenesis imperfecta (OI) are caused by glycine substitutions in type I collagen α chains, which delay collagen folding, and cause the synthesis of collagen molecules with abnormal structure and post-translational modifications. A variable extent of mutant collagen retention in the endoplasmic reticulum (ER) and other secondary mutation effects perturb osteoblast homeostasis and impair bone matrix quality. The chemical chaperone 4-phenylbutyrate (4- PBA) ameliorates both OI osteoblast homeostasis and the extracellular matrix (ECM) they deposit. The secretome of primary osteoblast extracted from the OI murine model Amish carrying a Gly substitution in the type I collagen α2 chain was here analysed by Nano LC-ESI-MS/MS and bioinformatic analyses to investigate the pathways affected by the disease. The effect of 4-PBA was also evaluated to clarify the mechanism of action of the drug. Proteins only present in Amish OBs secretome were mainly involved in cytoskeleton organization and cell adhesion, HIPPO, glutamate signaling and senescence. The first proteins likely underly a cell attempt to rescue the OB compromised phenotype. The presence of the negative regulators of osteoblast differentiation and mineralization olfactomedin-like 2 and TAOK2 acting on the Salvador-Warts-Hippo signaling further clarifies the reasons of mutant OBs malfunction. The presence of proteins involved in glutamate signaling could either underline the Amish inability to deal with the glutamate pathway, or the Amish attempt to control the production and the release of glutamate to try to ameliorate OBs homeostasis. Importantly, the presence of senescence markers indicates that mutant OBs undergo senescence, likely as a response to ER stress due to misfolded collagen retention, leading to a premature functional decline in Amish bone. 4-PBA treatment stimulated the secretion of proteins involved in cytoskeleton organization and cell adhesion as LIM zinc finger domain containing 1 (PINCH1) and noncatalytic region of tyrosine kinase (NCK1) and also promoted the secretion of N-myc downstream regulated gene 1 (NDRG1), an important factor regulating Wnt/β-catenin and cell adhesion. The treatment also increased calbindin 1(CALB1), which buffers the rise in intracellular Ca2+ levels typical of aged cells avoiding its cytotoxic effects, and forkhead box o3 (FOXO3), which activates the expression of genes related to protein turnover, thus likely stimulating an adaptative response to reverse senescence.

La maggior parte dei casi di osteogenesi imperfetta (OI) con ereditarietà dominante sono causati dalla sostituzione della glicina all’interno delle catene α del collagene di tipo I, che ritarda il ripiegamento del collagene e causa la sintesi di molecole di collagene con struttura alterata ed un eccesso di modifiche post-traduzionali. Il collagene mutato viene parzialmente trattenuto nel reticolo endoplasmatico (ER) perturbando l’omeostasi degli osteoblasti e compromettendo la qualità della matrice ossea che essi producono. Lo chaperone chimico 4-fenilbutirrato (4-PBA) migliora sia l'omeostasi cellulare degli osteoblasti OI che la matrice extracellulare (ECM) che essi depositano. Il secretoma degi osteoblasti primari estratti dal modello murino Amish di OI che porta una sostituzione della Gly nella catena α2 del collagene di tipo I è stato qui analizzato mediante Nano LC-ESI-MS/MS e analisi bioinformatiche per studiare i meccanismi molecolari della malattia. È stato valutato anche l'effetto del 4-PBA per chiarire il meccanismo d'azione del farmaco. Le proteine presenti solo nel secretoma degli OB Amish erano principalmente coinvolte nell'organizzazione del citoscheletro e nell'adesione cellulare, nell'HIPPO pathway, nella segnalazione del glutammato e nella senescenza. La presenza delle prime proteine probabilmente sottolinea un tentativo cellulare di salvare il fenotipo compromesso degli OB. La presenza dei regolatori negativi della differenziazione e della mineralizzazione degli osteoblasti olfattomedin-like 2 e TAOK2 che agiscono sul segnale Salvador-Warts-Hippo chiarisce ulteriormente le ragioni del malfunzionamento degli OB mutanti. La presenza di proteine coinvolte nella segnalazione del glutammato potrebbe sottolineare l’incapacità degli Amish di gestire la via del glutammato, oppure il tentativo degli Amish di controllare la produzione e il rilascio di glutammato per cercare di migliorare l’omeostasi degli OB. È importante sottolineare che la presenza di marcatori di senescenza indica che gli OB mutanti subiscono senescenza, probabilmente come risposta allo stress ER dovuto alla ritenzione di collagene mal ripiegato, portando a un declino funzionale prematuro nell'osso Amish. Il trattamento con 4-PBA ha stimolato la secrezione di proteine coinvolte nell'organizzazione del citoscheletro e nell'adesione cellulare come il dominio LIM zinc finger contenente 1 (PINCH1) e la regione non catalitica della tirosina chinasi (NCK1) e ha anche promosso la secrezione del gene regolato a valle N-myc 1 (NDRG1), un fattore importante che regola Wnt/β-catenina e l'adesione cellulare. Il trattamento ha anche aumentato la calbindina 1 (CALB1), che tampona l’aumento dei livelli intracellulari di Ca2+, tipico delle cellule invecchiate, evitandone i suoi effetti citotossici, e la forkhead box o3 (FOXO3), che attiva l’espressione dei geni legati al turnover proteico, stimolando così probabilmente una risposta adattativa che cerca di revertire la senescenza.