Organoidi derivati da cellule umane staminali come modello per studiare il parkinson associato alla mutazione GBA

Parkinson's disease (PD) is a complex neurodegenerative disorder characterized by the loss of dopaminergic neurons in the nigrostriatal pathway of the brain, resulting in motor dysfunction. Many factors, including environmental factors and genetics, are known to contribute to disease risk, yet, a cure remains elusive, emphasizing the need for a deeper understanding of PD mechanisms. To address this, our study introduces an innovative 3D model, in which we generate miniaturized controlled organoids (MiCOs) from patient-derived human induced pluripotent stem cells. Previous midbrain organoid protocols faced many challenges, including high costs, experiment reproducibility issues, organoid size heterogeneity, and the generation of necrotic centers. Our novel protocol, incorporating an embryoid bodies (EB) disk to minimize adhesion and control organoid size, addresses these concerns. Initially tested successfully on an H9 cell line, this protocol is now applied to a patient-derived cell line which presents a mutation in the GBA gene. GBA mutation, considered one of the primary mutations causing PD, affects glucocerebrosidase, a lysosomal enzyme crucial for glucocerebroside metabolism. This mutation disrupts lysosomal function and correlates with α-synuclein aggregation, a protein involved in neurotransmitter release, and it is considered a central hallmark of PD. The presence of α-synuclein in PD models is crucial, due to its relevant presence inthe development of the pathology. To validate our model α-synuclein detection was carried out, giving an unexpected outcome. Despite comparable size and pattern differentiation, α-synuclein was undetected, necessitating the exploration of more sensitive analytical methods. To assess promising treatments and demonstrate the potential of MiCOs for drug screening, we tested two compounds, methoctramine and adrenochrome, known to inhibit aggregation and potentially treat PD. However, the observed toxicity of this compounds highlights the complexity of developing safe and effective treatments. Additionally. a mucolytic agent known to increase glucocerebrosidase activity and reduce phosphorylated α-synuclein levels known as ambroxol was investigated. Since preliminary results showed low increased GCase activity, further investigation is required, considering the relatively short time of exposure to the compound. As it is already under clinical trial, continuing the testing of ambroxol on MiCOs can enrich and validate them for drug screening. The generated MiCOs, analyzed throughout their developmental stages, serve as a valuable tool for PD modeling and drug screening studies. The use of MiCOs can contribute to advancing our understanding of PD mechanisms and evaluating potential therapeutic interventions.

Il morbo di Parkinson (PD) è un complesso disturbo neurodegenerativo caratterizzato dalla perdita di neuroni dopaminergici nel percorso nigrostriatale del cervello, che si traduce in disfunzioni motorie. Molti fattori, tra cui fattori ambientali e genetici, sono noti per contribuire al rischio di malattia; tuttavia, una cura non è stata ancora trovata, sottolineando la necessità di una comprensione più approfondita dei meccanismi del PD. Per affrontare questa sfida, il nostro studio introduce un innovativo modello tridimensionale (3D), in cui generiamo organoidi miniaturizzati controllati (MiCOs) generati da cellule staminali pluripotenti indotte umane derivate dai pazienti. I protocolli precedenti per gli organoidi del mesencefalo hanno affrontato diverse sfide, tra cui costi elevati, problemi di riproducibilità degli esperimenti, eterogeneità delle dimensioni degli organoidi e la formazione di centri necrotici. Il nostro nuovo protocollo, che incorpora un disco di corpi embrioidi (EB) per ridurre l'adesione tra organoidi e controllarne le dimensioni, affronta tali preoccupazioni. Inizialmente testato con successo su una linea cellulare H9, questo protocollo è ora applicato a una linea cellulare derivata dal paziente che presenta una mutazione nel gene GBA. La mutazione del gene GBA, considerata una delle principali mutazioni causanti il PD, colpisce la glucocerebrosidasi, un enzima lisosomiale cruciale per il metabolismo del glucocerebroside. Questa mutazione interrompe la funzione lisosomiale e si correla con l'aggregazione dell'α-sinucleina, una proteina coinvolta nel rilascio dei neurotrasmettitori e considerata un tratto caratteristico del PD. La presenza di α-sinucleina nei modelli di PD è cruciale, dato il suo ruolo rilevante nello sviluppo della patologia. Per convalidare il nostro modello, è stata effettuata un’analisi di rilevazione dell'α-sinucleina, il quale ha portato ad un esito inaspettato. Nonostante le dimensioni comparabili, così come il pathway di differenziamento, l'α-sinucleina non è stata rilevata, richiedendo l’utilizzo di metodi analitici più sensibili. Per valutare molecole promettenti e dimostrare il potenziale dei MiCOs per lo screening farmacologico, abbiamo testato due composti, metoctramina e adrenocromo, noti per inibire l'aggregazione e potenzialmente trattare il PD. Tuttavia, la tossicità osservata di questi composti evidenzia la complessità dello sviluppo di trattamenti sicuri ed efficaci. Inoltre, è stato indagato un agente mucolitico, chiamato ambroxolo, noto per aumentare l'attività della glucocerebrosidasi e ridurre i livelli di α-sinucleina fosforilata. Dati i risultati preliminari che mostrano un leggero aumento dell'attività di GCase, è necessaria un'ulteriore indagine, tenendo in considerazione il tempo relativamente breve di esposizione al composto. Poiché questa molecola è già in fase di sperimentazione clinica, continuare i test con l’ambroxolo su MiCOs può permettere di convalidarli per lo screening di farmaci. I MiCOs generati e analizzati durante le varie fasi di sviluppo, si rivelano uno strumento prezioso per creare modelli di PD in vitro e per gli studi di screening di farmaci. L'uso dei MiCOs può contribuire a far progredire la nostra comprensione dei meccanismi della PD e valutare possibili interventi terapeutici.