Caratterizzazione in vivo del ruolo di polη nel metabolismo dei G-quadruplex

DNA is constantly exposed to damage that can alter its structure. Despite the existence of various repair pathways, some damage can still be present at the start of phase S of the cell cycle. For this reason, cells have developed damage tolerance mechanisms, including translesion synthesis (TLS). TLS utilizes non-canonical polymerases specialized in bypassing different kinds of damage. Among these enzymes, polymerase η (Polη) is the primary polymerase involved in UV-induced pyrimidine dimers (CPDs) bypass. In the last decades, new roles have emerged for this protein. Polη is involved in the replication through intrinsically difficult-to-replicate regions, such as common fragile sites (CFS), and it can replicate across G-quadruplexes (G4s) in vitro. G4s are non-canonical structures composed of guanine tetrads paired with Hoogsteen bonds and coordinated by cations. Despite the many helicases that can resolve them, the replication through these structures is still not completely understood. This study investigates the putative role of Polη in G-quadruplexes metabolism using the compound pyridostatin (PDS), which stabilizes these structures. To this aim, we exploited a cellular model composed of the XP30RO cell line, which lacks Polη, and its derived clones re-expressing polη WT or mutating in different functional domains. By employing immunofluorescence, western blot, flow cytometry, and Real time-PCR, we demonstrated a catalytic role of Polη in the replication of G4-containing regions. In particular, after PDS treatment, we observed a reduction in G4 accumulation based on the expression of catalytically active Polη. At the same time, after PDS treatment, we observed an increase in the polymerase protein levels. Furthermore, investigation of the protein overexpression revealed an increase in the transcript for this polymerase upon G4 stabilization. Finally, the analysis of the induction of the DNA damage response (DDR) after PDS demonstrated a differential activation depending on the expression of this polymerase.

Il DNA è continuamente esposto a danni che ne possono alterare la struttura. Nonostante la presenza di diversi pathway di riparazione, non tutto il DNA viene correttamente riparato prima dell’inizio della fase S del ciclo cellulare. Per questo motivo, le cellule hanno sviluppato meccanismi di tolleranza al danno, tra cui la sintesi translesione (TLS). La TLS si avvale di polimerasi non canoniche, le polimerasi TLS, ciascuna delle quali è specializzata nel bypass di diverse tipologie di danno. Tra questi enzimi, la polimerasi η (Polη) è la principale polimerasi coinvolta nel bypass dei dimeri di pirimidina (CPDs) indotti dai raggi UV. Negli ultimi decenni nuovi ruoli sono emersi per questa proteina. Polη infatti è coinvolta nella replicazione di regioni difficili da replicare, come i common fragile sites (CFS), ed è inoltre in grado di replicare attraverso i G-quadruplex in vitro. I G4 sono strutture non canoniche composte da tetradi di guanine appaiate tra loro con legami di Hoogsteen e coordinate da cationi. Nonostante la presenza di molte elicasi in grado di risolverli, la replicazione attraverso queste strutture è ancora da chiarire. In questo lavoro è stato indagato il putativo ruolo di Polη nella risoluzione dei G-quadruplex, utilizzando il farmaco piridostatina (PDS) che risulta in grado di stabilizzare queste strutture. A tal fine è stato utilizzato un modello cellulare composto dalla linea XP30RO, che è deficiente per Polη,e da dei cloni da essa derivati in cui Polη, sia essa WT o mutata nei diversi domini funzionali, è stata ri-espressa. Tramite l’utilizzo di tecniche di Immunofluorescenza, Western blot, citofluorimetria e Real time -PCR abbiamo evidenziato un ruolo catalitico di Polη nella replicazione di regioni contenenti G4. In particolare, in seguito al trattamento con PDS, è stata osservata una riduzione dell’accumulo di G4 dipendente dall’espressione di Polη cataliticamente attiva. Contestualmente è stato osservato un aumento dei livelli proteici della polimerasi dopo PDS. Inoltre indagini sulla sovraespressione della proteina hanno evidenziato un aumento del trascritto per questa polimerasi in seguito a stabilizzazione dei G4. Infine indagini sull’induzione della risposta al danno al DNA (DDR) dopo PDS hanno evidenziato una sua diversa attivazione in maniera dipendente dall’espressione di questa importante polimerasi.