Ruolo della proteina Wiskott-Aldrich syndrome (WASp) nelle funzioni fisiopatologiche della microglia e dei macrofagi residenti del cervello

Wiskott-Aldrich Syndrome (WAS) is a rare genetic disorder caused by mutations in the was gene located on the X chromosome. The was gene is primarily expressed in hematopoietic cells, and its transcript, the WAS protein, plays a crucial role in the maturation and function of leukocytes. This disease affects male children with an incidence ranging from 1 to 10 per million. WAS symptoms may emerge in early childhood, encompassing recurrent infections, eczema, autoimmune diseases, and an elevated risk of tumor development. Clinical observations report neurological manifestations in approximately 40% of WAS patients, but the mechanisms behind these manifestations remain unclear. Within the brain, WASp is expressed by microglia and cerebral-associated macrophages (CAM), the two resident immune populations in the central nervous system. Microglia and CAM play vital roles in neurodevelopment and neuroinflammation, processes that may be altered in the absence of WASp. To investigate WASp's involvement in the functions of microglia and CAM, we isolated cerebral immune populations from human-induced pluripotent stem cells (h-iPSCs). We initially characterized the expression of selective genetic markers (Hexb, p2ry12 for microglia and cd163, cd169, cd68 for CAM) and was, observing that only microglia were able to express high levels of was. Subsequently, we subjected microglia to a phagocytosis assay using time-lapse confocal microscopy. Cells were activated or not with LPS or TNF-α and IL1β, in the presence or absence of WASp inhibitors, namely Wiskostatin and CK-666. We observed an increase in phagocytic capacity when microglia cells were exposed to TNF-α and IL1β; however, this capacity was inhibited when cells were treated with Wiskostatin (5 µM) or CK-666 (100 µM). To ensure data reliability, we conducted phagocytosis assays on two microglial lines derived from GIBCO and NYSCF progenitors, yielding similar results. We then carried out motility analyses on both lines and observed that the NYSCF line, activated by the inflammatory stimulus of TNF-α and IL1β and inhibited with CK-666, had altered motility compared with the non-activated or only activated groups. This may reflect abnormal phagocytic activity. Consistent with the hypothesis that WASp inhibition alters the phagocytic capacity of microglia, we observed in co-cultures of microglia, neurons, and astrocytes treated with the inhibitors, a greater presence of synapses than in control groups, suggesting a reduced capacity of synaptic pruning by microglia. When analyzing CAM, we observed that their was expression was induced only in the presence of the LPS stimulus (1 µg/mL). When the activated CAMs were treated with the inhibitor Wiskostatin, they did not assume the typical elongated shape of phagocytic cells, indicating altered functionality. These findings indicate the importance of WASp in the functionality of microglia and CAM. Its absence results in alterations in the phagocytic function of these cells, potentially underpinning the neurological manifestations of the syndrome.

La sindrome di Wiskott-Aldrich (WAS) è una malattia genetica rara causata da mutazioni nel gene was situato sul cromosoma X. Questo gene è espresso principalmente dalle cellule ematopoietiche e il suo trascritto, la proteina WAS, è importante per la maturazione e la funzione dei leucociti. Questa malattia colpisce i bambini di sesso maschile con un’incidenza che va da 1 a 10 maschi per milione. I sintomi della sindrome possono manifestarsi già nei primi anni di sviluppo e comprendono infezioni ricorrenti, eczemi, malattie autoimmuni ed elevata probabilità di sviluppare tumori. Osservazioni cliniche riportano che circa il 40% dei soggetti WAS presenta delle manifestazioni neurologiche, i cui meccanismi non sono chiari. Nel cervello, WASp è espressa dalla microglia e dai macrofagi (cerebral associated macrophages, CAM), le due popolazioni immunitarie residenti nel sistema nervoso centrale. Tra le loro funzioni più importanti, microglia e CAM hanno un ruolo nei processi di neurosviluppo e di neuroinfiammazione, che potrebbero essere alterati in assenza di WASp. Allo scopo di studiare se WASp sia coinvolta nelle funzioni di microglia e CAM, in questo studio abbiamo ottenuto le popolazioni immunitarie cerebrali a partire da cellule umane staminali pluripotenti indotte (h-iPSC). Abbiamo inizialmente caratterizzato l’espressione di marcatori genetici selettivi (Hexb, p2ry12 per la microglia e cd163, cd169, cd68 per i CAM) e di was, osservando che solo la microglia era in grado di esprimere alti livelli di was. Abbiamo quindi sottoposto la microglia ad un saggio di fagocitosi mediante microscopia confocale time lapse. Le cellule sono state attivate o meno con LPS o TNF-α e IL1β, in presenza o meno degli inibitori Wiskostatin e CK-666, specifici per WASp. Abbiamo osservato che la microglia aumentava la sua capacità fagocitica se esposta a TNF-α e IL1β, ma, quando trattata con Wiskostatin (5 µM) o con CK-666 (100 µM), questa capacità veniva inibita. Per avere un dato solido sulla microglia, abbiamo effettuato il saggio di fagocitosi su due linee microgliali, una ottenuta da progenitori GIBCO ed una da progenitori NYSCF, riportando risultati analoghi. Abbiamo poi effettuato delle analisi di motilità su entrambe le linee e abbiamo osservato che la linea NYSCF, attivata dallo stimolo infiammatorio di TNF-α e IL1β e inibita con CK-666, aveva una motilità alterata rispetto ai gruppi non attivati o solo attivati che sembra rispecchiare un’attività fagocitica anomala. In linea con l’ipotesi che l’inibizione di WASp alteri la capacità fagocitica della microglia, abbiamo osservato in co-culture di microglia, neuroni e astrociti trattate con gli inibitori, una maggiore presenza di sinapsi rispetto ai gruppi controllo, suggerendo una ridotta capacità di pruning sinaptico. Analizzando i CAM, abbiamo osservato che la loro espressione di was veniva indotta solo se in presenza dello stimolo con LPS (1 µg/mL). Quando i CAM attivati venivano trattati con l’inibitore Wiskostatin, non assumevano la tipica forma elongata delle cellule fagocitiche, suggerendone un’alterata funzionalità. Questi dati sembrano quindi dimostrare che WASp sia importante per la funzionalità della microglia e dei CAM. In particolare, la sua assenza determina delle alterazioni nella funzionalità fagocitica di queste cellule, che potrebbe essere alla base delle manifestazioni neurologiche della sindrome.