The development of a bispecific anti-Met single-chain diabody and the challenge to best characterize it

Introduction: In 1973, Jerrold Schwaber first described the production of monoclonal antibodies using hybrid cells from humans and mice. In the clinic, the effectiveness and specificity of conventional drugs based on monoclonal antibodies have encouraged further studies to optimise, improve and refine possible therapeutic strategies. Particularly relevant are bispecific monoclonal antibodies which, unlike classic monoclonal antibodies, are capable of binding two different epitopes of the same antigen or two different epitopes of two antigens. This dual specificity opens up a wide range of applications, including redirecting T cells to tumour cells, simultaneously blocking two different signalling pathways, and dual targeting of disease mediators. The Met receptor is an important receptor tyrosine kinase involved in normal cell embryonal development and motility, but due to the physiological functions in which it is involved, aberrant activation of Met can lead to both tumour growth and metastatic progression of tumour cells. The aberrant activation of Met can be due both to intracellular signalling, induced by the mutation of the gene encoding the receptor, and to extracellular signalling induced by its natural ligand, hepatic growth factor or scattering factor (HGF/SF). Methods: In this thesis project, a bispecific monoclonal antibody was designed, synthesised and tested, derived from two scFvs, 1O7 and 3H3, which recognize two different epitopes of the Met receptor. Thanks to the high modulability of the construct coding for the antibody, it was possible to obtain, through various cloning steps, a second DNA sequence coding for a second bispecific monoclonal antibody derived from scFvs 1O7 and 1G2. Results: Stability and binding tests were performed on the bispecific antibody 1O7-3H3, the excellent results obtained encouraged us to also perform in-vitro tests using cells that easily undergo the scattering process or that overexpress the Met receptor. Conclusions: The results obtained have allowed us to build hypotheses that can only be verified with more in-depth tests. The effect of the bispecific monoclonal antibody 1O7-3H3 on tumour cells has not yet been completely clarified, but a cytotoxic effect has been observed for tumour cells that over-express Met, probably induced by the internalization of the receptor itself.

Introduzione: Nel 1973, Jerrold Schwaber descrive per la prima volta la produzione di anticorpi monoclonali usando cellule ibride provenienti da uomo e topo. In clinica l’efficacia e la specificità dei farmaci convenzionali a base di anticorpi monoclonali ha incoraggiato ulteriori studi per ottimizzare, migliorare e affinare le possibili strategie terapeutiche. Particolarmente rilevanti sono risultati gli anticorpi monoclonali bispecifici i quali, a differenza dei classici anticorpi monoclonali, sono in grado di legare due epitopi diversi dello stesso antigene o due epitopi diversi di due antigeni. Questa doppia specificità apre un’ampia gamma di applicazioni, tra cui il reindirizzamento delle cellule T verso le cellule tumorali, il blocco simultaneo di due diversi pathway di segnalazione e il duplice targeting di mediatori della malattia. Il recettore Met è un importante recettore tirosin-chinasico coinvolto nel normale sviluppo embrionale e motilità cellulare, ma per le funzioni fisiologiche in cui è coinvolto, l’attivazione aberrante di Met può portare sia alla crescita dei tumori che alla progressione metastatica delle cellule tumorali. L’attivazione aberrante di Met può essere dovuta sia da una segnalazione intracellulare, indotta dalla mutazione del gene codificante il recettore, che da una segnalazione extracellulare indotta dal suo ligando naturale, il fattore di crescita epatico o fattore di scattering (HGF/SF), oppure indipendente dal ligando a causa della sua sovraespressione. Metodi: In questo progetto di tesi è stato disegnato, sintetizzato e testato un anticorpo monoclonale bispecifico, derivato da due scFv, 1O7 e 3H3, che riconoscono due epitopi diversi del recettore Met. Grazie all'elevata modulabilità del costrutto che codifica per l’anticorpo è stato possibile ottenere, tramite diversi clonaggi, una seconda sequenza di DNA codificante per un secondo anticorpo monoclonale bispecifico derivato dai scFv 1O7 e 1G2. Risultati: Test di stabilità e di binding sono stati eseguiti su l’anticorpo bispecifico 1O7-3H3, gli ottimi risultati ottenuti ci hanno spinto ad eseguire anche test in-vitro utilizzando cellule che facilmente vanno incontro al processo di scattering oppure che over esprimono il recettore Met. Conclusioni: I risultati ottenuti ci hanno permesso di costruire ipotesi che potranno essere verificate solo con test più approfonditi. L’ effetto dell’anticorpo monoclonale bispecifico 1O7-3H3 sulle cellule tumorali non è stato ancora completamente chiarito, ma è stato osservato un effetto citotossico per le cellule tumorali che over-esprimono Met, probabilmente indotto dalla internalizzazione del recettore stesso.