Varianti criptiche di splicing identificate mediante rianalisi dei dati di sequenziamento dell’esoma: una nuova strategia per migliorare la resa diagnostica nella sindrome di Joubert

La sindrome di Joubert (JS) è una patologia mendeliana complessa che rientra nel gruppo dei difetti congeniti del cervelletto e del tronco encefalico. È una patologia genetica rara ad ereditarietà prevalentemente autosomica recessiva, causata da varianti bialleliche riscontrate in circa 40 geni coinvolti nella biogenesi e nel corretto funzionamento del cilio primario. È caratterizzata da una malformazione congenita del tronco cerebrale e ipoplasia del verme cerebellare. Il segno neuroradiologico distintivo è il “segno del dente molare” (MTS), rilevabile in seguito a RNM encefalica. I segni clinici principali sono: ipotonia, atassia, ritardo dello sviluppo motorio e intellettivo; queste manifestazioni possono essere associate in modo variabile al coinvolgimento di diversi organi quali retina, reni e fegato, in base al gene mutato. Ad oggi, nonostante i progressi compiuti nei settori del neuroimaging e della diagnostica molecolare, circa il 30-40% dei pazienti con diagnosi clinica e neuroradiologica di JS rimangono senza diagnosi genetica, vivendo la cosiddetta “odissea diagnostica”. L’obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di analizzare i dati ottenuti dal sequenziamento dell’intero esoma (WES) di 11 pazienti con diagnosi clinica e neuroradiologica di JS, reclutati dall’Unità di Biologia Generale e Genetica Medica coordinata dalla Prof.ssa Valente, al fine di identificare, ove possibile, la variante genetica responsabile del fenotipo clinico. Come primo step, è stata eseguita un’analisi delle regioni codificanti dei geni noti e delle varianti canoniche di splicing, grazie alla quale è stato possibile definire la diagnosi genetica in 5 pazienti. Successivamente, per i casi negativi, si è proceduto con una rianalisi dei dati includendo anche le varianti sinonime e le regioni introniche indagabili con questo tipo di sequenziamento. In seguito a ciò, in 3 pazienti sono state individuate 3 differenti varianti criptiche, predette alterare lo splicing, per le quali si è proceduto alla validazione in vitro tramite saggio minigene. Tale saggio ha permesso di confermare la patogenicità di una delle varianti identificate, in un secondo caso ha dato esito negativo (anche se, a causa di alcune limitazioni del saggio stesso, non possiamo escludere definitivamente tale variante come causativa della patologia), mentre la terza variante è attualmente in fase di studio. Questo a dimostrazione del fatto che le alterazioni dello splicing sono un meccanismo mutazionale potenzialmente rilevante nella JS e il loro studio potrebbe aumentare significativamente la resa diagnostica. Infine, è importante sottolineare che i pazienti rimasti senza diagnosi genetica rappresentano una coorte molto promettente per ulteriori indagini volte a svelare altre classi di varianti criptiche, utilizzando tecnologie innovative in grado di sequenziare le regioni più profonde del genoma umano.