Throughout history, the question of what exactly constitutes the unique features of humans has always fascinated researchers. What sets us apart from great apes seems to be the remarkable capacity of our brains (Sousa et al., 2017). Differences in cognitive abilities between humans and non-human primates are believed to be attributed to more complex neural architectures in humans, resulting from a larger number of neurons (Herculano-Houzel, 2012). To understand the cell biological bases of brain evolution, it is particularly relevant to study morphological and functional changes at the single cell level in neurons, comparing human and non-human primates. The development of in vitro systems, such as induced pluripotent stem cell (iPSCs) technology, has greatly expanded the range of possible studies (Takahashi & Yamanaka, 2006), allowing researchers to conduct comparative studies at the single-cell level. In this project, we generated induced excitatory neurons (iNeurons) from chimpanzees and human iPSCs by inducing the expression of the transcription factor Neurogenin-2 (NGN2). Based on the work of Schörnig and Taverna in 2021, which demonstrated that, at the functional level, human iNs mature more slowly than apes iNs, we hypothesized that the difference in the functional maturation of the two species might be due to differences in the cellular biology of synapse maturation. In my thesis project, we investigated species-specific differences by following the morphological maturation of dendritic spines of iPSCs-derived neurons at a specific time point, day 28. To this end we developed a sparse labeling method to track individual iNs and using super-resolution microscopy, we revealed the morphology of the spines in both species. Subsequently, we assessed the composition of the post-synaptic compartment by immunofluorescence staining with Phalloidin (which specifically labels the actin cytoskeleton). And finally, we classified spines based on their morphotype. Acquired images of dendritic spines revealed the presence of a spine morpho-class different from what has been previously reported for rodents’ neurons, defined as atypical, with a triangular and sail-like shape. Immunofluorescence experiments with Phalloidin showed that atypical spines are actin-based protrusions. From the quantification analyses we observed no significant difference in the total number of spines between the two species nor in the distribution of morphotypes. Therefore, these results suggest that the functional differences reported and measured in network activity from Schörnig's experiments do not appear to be directly caused by a difference in the total number of dendritic spines.

Nel corso della storia, la domanda su cosa costituisca esattamente le proprietà uniche degli esseri umani ha da sempre affascinato i ricercatori. Ciò che ci distingue dalle grandi scimmie sembrerebbe essere la notevole capacità del nostro cervello (Sousa et al., 2017). Si ritiene che le differenze nelle capacità cognitive tra gli esseri umani e i primati non umani siano attribuite ad architetture neurali più complesse negli esseri umani, risultato di un maggior numero di neuroni (Herculano-Houzel, 2012). Per comprendere le basi biologiche cellulari dell'evoluzione cerebrale, è particolarmente rilevante studiare i cambiamenti morfologici e funzionali a livello di singola cellula nei neuroni, confrontando primati umani e non umani. Lo sviluppo di sistemi in vitro, come la tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), ha ampliato notevolmente la gamma di studi possibili (Takahashi & Yamanaka, 2006), permettendo ai ricercatori di condurre studi comparativi a livello di singola cellula. In questo progetto, abbiamo generato neuroni eccitatori indotti (iNeurons) da iPSCs di scimpanzé e umani inducendo l'espressione del fattore di trascrizione Neurogenina-2 (NGN2). Basandoci sul lavoro di Schörnig e Taverna del 2021, il quale ha dimostrato che, a livello funzionale, gli iNs umani maturano più lentamente rispetto agli iNs di scimmia, abbiamo ipotizzato che la differenza nella maturazione funzionale delle due specie possa essere dovuta a differenze nella biologia cellulare della maturazione delle sinapsi. Nel mio progetto di tesi, abbiamo studiato le differenze specie-specifiche seguendo la maturazione morfologica delle spine dendritiche dei neuroni derivati da iPSCs in un momento specifico, il giorno 28. A tal fine, abbiamo sviluppato un metodo di etichettatura rada per tracciare i singoli iNs e, utilizzando la microscopia a super-risoluzione, abbiamo rivelato la morfologia delle spine in entrambe le specie. Successivamente, abbiamo valutato la composizione del compartimento postsinaptico mediante colorazione in immunofluorescenza con falloidina (che marca specificamente il citoscheletro di actina). Infine, abbiamo classificato le spine in base al loro morfotipo. Le immagini acquisite delle spine dendritiche hanno rivelato la presenza di una classe morfologica di spine diversa da quella precedentemente riportata per i neuroni dei roditori, definita atipica, con una forma triangolare e a vela. Esperimenti di immunofluorescenza con falloidina hanno mostrato che le spine atipiche sono protrusioni basate sull'actina. Dalle analisi di quantificazione non abbiamo osservato differenze significative nel numero totale di spine tra le due specie né nella distribuzione dei morfotipi. Pertanto, questi risultati suggeriscono che le differenze funzionali riportate e misurate nell'attività di rete dagli esperimenti di Schörnig non sembrano essere direttamente causate da una differenza nel numero totale di spine dendritiche.

Utilizzo di neuroni derivati da iPSC per studiare la maturazione delle spine dendritiche nell'uomo e nello scimpanzé

BELTRAME, MARGHERITA
2022/2023

Abstract

Throughout history, the question of what exactly constitutes the unique features of humans has always fascinated researchers. What sets us apart from great apes seems to be the remarkable capacity of our brains (Sousa et al., 2017). Differences in cognitive abilities between humans and non-human primates are believed to be attributed to more complex neural architectures in humans, resulting from a larger number of neurons (Herculano-Houzel, 2012). To understand the cell biological bases of brain evolution, it is particularly relevant to study morphological and functional changes at the single cell level in neurons, comparing human and non-human primates. The development of in vitro systems, such as induced pluripotent stem cell (iPSCs) technology, has greatly expanded the range of possible studies (Takahashi & Yamanaka, 2006), allowing researchers to conduct comparative studies at the single-cell level. In this project, we generated induced excitatory neurons (iNeurons) from chimpanzees and human iPSCs by inducing the expression of the transcription factor Neurogenin-2 (NGN2). Based on the work of Schörnig and Taverna in 2021, which demonstrated that, at the functional level, human iNs mature more slowly than apes iNs, we hypothesized that the difference in the functional maturation of the two species might be due to differences in the cellular biology of synapse maturation. In my thesis project, we investigated species-specific differences by following the morphological maturation of dendritic spines of iPSCs-derived neurons at a specific time point, day 28. To this end we developed a sparse labeling method to track individual iNs and using super-resolution microscopy, we revealed the morphology of the spines in both species. Subsequently, we assessed the composition of the post-synaptic compartment by immunofluorescence staining with Phalloidin (which specifically labels the actin cytoskeleton). And finally, we classified spines based on their morphotype. Acquired images of dendritic spines revealed the presence of a spine morpho-class different from what has been previously reported for rodents’ neurons, defined as atypical, with a triangular and sail-like shape. Immunofluorescence experiments with Phalloidin showed that atypical spines are actin-based protrusions. From the quantification analyses we observed no significant difference in the total number of spines between the two species nor in the distribution of morphotypes. Therefore, these results suggest that the functional differences reported and measured in network activity from Schörnig's experiments do not appear to be directly caused by a difference in the total number of dendritic spines.
2022
Using iPSCs-derived neurons to study dendritic spines maturation in human and chimpanzee
Nel corso della storia, la domanda su cosa costituisca esattamente le proprietà uniche degli esseri umani ha da sempre affascinato i ricercatori. Ciò che ci distingue dalle grandi scimmie sembrerebbe essere la notevole capacità del nostro cervello (Sousa et al., 2017). Si ritiene che le differenze nelle capacità cognitive tra gli esseri umani e i primati non umani siano attribuite ad architetture neurali più complesse negli esseri umani, risultato di un maggior numero di neuroni (Herculano-Houzel, 2012). Per comprendere le basi biologiche cellulari dell'evoluzione cerebrale, è particolarmente rilevante studiare i cambiamenti morfologici e funzionali a livello di singola cellula nei neuroni, confrontando primati umani e non umani. Lo sviluppo di sistemi in vitro, come la tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), ha ampliato notevolmente la gamma di studi possibili (Takahashi & Yamanaka, 2006), permettendo ai ricercatori di condurre studi comparativi a livello di singola cellula. In questo progetto, abbiamo generato neuroni eccitatori indotti (iNeurons) da iPSCs di scimpanzé e umani inducendo l'espressione del fattore di trascrizione Neurogenina-2 (NGN2). Basandoci sul lavoro di Schörnig e Taverna del 2021, il quale ha dimostrato che, a livello funzionale, gli iNs umani maturano più lentamente rispetto agli iNs di scimmia, abbiamo ipotizzato che la differenza nella maturazione funzionale delle due specie possa essere dovuta a differenze nella biologia cellulare della maturazione delle sinapsi. Nel mio progetto di tesi, abbiamo studiato le differenze specie-specifiche seguendo la maturazione morfologica delle spine dendritiche dei neuroni derivati da iPSCs in un momento specifico, il giorno 28. A tal fine, abbiamo sviluppato un metodo di etichettatura rada per tracciare i singoli iNs e, utilizzando la microscopia a super-risoluzione, abbiamo rivelato la morfologia delle spine in entrambe le specie. Successivamente, abbiamo valutato la composizione del compartimento postsinaptico mediante colorazione in immunofluorescenza con falloidina (che marca specificamente il citoscheletro di actina). Infine, abbiamo classificato le spine in base al loro morfotipo. Le immagini acquisite delle spine dendritiche hanno rivelato la presenza di una classe morfologica di spine diversa da quella precedentemente riportata per i neuroni dei roditori, definita atipica, con una forma triangolare e a vela. Esperimenti di immunofluorescenza con falloidina hanno mostrato che le spine atipiche sono protrusioni basate sull'actina. Dalle analisi di quantificazione non abbiamo osservato differenze significative nel numero totale di spine tra le due specie né nella distribuzione dei morfotipi. Pertanto, questi risultati suggeriscono che le differenze funzionali riportate e misurate nell'attività di rete dagli esperimenti di Schörnig non sembrano essere direttamente causate da una differenza nel numero totale di spine dendritiche.
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14239/16895