Deficit di Alpha1-antitripsina: nuovi metodi per identificare le varianti rare Mwhitstable e Mwurzburg

The diagnostic algorithm used for the detection of AATD comprises different methods and procedures that are performed at the Centre for Diagnosis of Inherited Alpha1-antitrypsin Deficiency in Pavia. Among the rare AAT variants, the group of the M-like variants presents the same electrophoretic pattern of the M wild-type protein. These variants are not easy to be detected with classical routine analysis; specific molecular biology techniques such as sequencing are needed to identify them. This work of thesis is focused on two M-like variants: Mwhitstable and Mwurzburg. Mwhitstable is an intronic variant consisting of a 26-bp deletion associated with an insertion of two deoxyguanosine residues (g.11640del26bp, insGG) in intron 4. Mwurzburg (p.P393S c.1177 C>T) variant, instead, is caused by a point mutation in exon 5 and causes the formation of polymers. The identification of Mwhitstable and Mwurzburg variants is usually performed through intron 4 and exon 5 sequencing, respectively. Since sequencing is an expensive and time-consuming method, we developed a new assay for the identification of these M-like variants. The aim of this work of thesis was the setup of new assays for the genotyping of Mwhitstable and Mwurzburg with the use of specific primers and probes (Integrated DNA Technologies IDT); to perform both the assays the PCR Light Cycler® real-time 480 (Roche) apparatus was used. The use of the specific assays for Mwhitstable and Mwurzburg enable the detection of these variants in a set of samples with suspected AATD. This work of thesis illustrates the setup of the new assays and demonstrates that the allelic frequencies of the two variants in the selected population with AATD suspicion are not so negligible: 0.017 (1.7%) for Mwhitstable variant and 0.006 (0.6%) for the Mwurzburg variant. A timely and correct diagnosis is important for the identification of patients carrying one of these alleles, and this can be more easily achieved by using the new assays herein described. Moreover, the development of the new assays based on the use of fluorescent probes will allow a quicker and cheaper identification, thus increasing the performance of the diagnostic algorithm.

L'alfa1-antitripsina (AAT) è un inibitore della serina-proteinasi (SERPIN) la cui funzione principale è il mantenimento dell'omeostasi proteasi-antiproteasi nei polmoni, dove protegge il tessuto alveolare dal danno proteolitico indotto da enzimi come l'elastasi neutrofila (NE). L’AAT è una glicoproteina di 52 kDa codificata dal gene altamente polimorfico SERPINA1, situato sul braccio lungo del cromosoma 14. Il deficit di alfa1-antitripsina (DAAT) è una malattia ereditaria autosomica causata da mutazioni nel gene SERPINA1 e caratterizzata da livelli sierici di AAT ridotti, che sono associati ad un maggior rischio di sviluppare malattie polmonari e/o epatiche. Le manifestazioni cliniche più comuni associate al DAAT sono le malattie polmonari, in particolare dispnea, tosse, enfisema e la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). Le principali manifestazioni epatiche sono l'epatite, la cirrosi e l'epatoma. La maggior parte delle mutazioni patologiche sono localizzate all'interno della regione codificante del gene SERPINA1 e diversi tipi di mutazioni portano a diversi cambiamenti nella proteina AAT, sia conformazionali che quantitativi. Tra le varianti genetiche del gene SERPINA1 che sono state trovate fino ad ora (fino a 450), la M è la forma normale della proteina, e le due varianti patologiche più comuni sono chiamate S e Z. L'algoritmo diagnostico utilizzato per la rilevazione del DAAT comprende diverse metodiche e procedure che vengono eseguite presso il Centro per la Diagnosi del Deficit Ereditario di Alfa1-Antitripsina di Pavia e i test diagnostici sono sia quantitativi che qualitativi. Tra le varianti rare dell’AAT, il gruppo delle varianti M-like presenta lo stesso pattern elettroforetico della proteina normale M. Queste varianti non sono facili da rilevare con i classici metodi di analisi; per identificarle sono necessarie tecniche specifiche di biologia molecolare come il sequenziamento. Questo lavoro di tesi è focalizzato su due varianti M-like: Mwhitstable e Mwürzburg. Mwhitstable è una variante intronica che consiste in una delezione di 26 bp associata all'inserzione di due residui di deossiguanosina (g.11640del26bp, insGG) nell'introne 4. La variante Mwürzburg (p.P393S c.1177 C>T), invece, è causata da una mutazione puntiforme nell'esone 5 e provoca la formazione di polimeri. L'identificazione delle varianti di Mwhitstable e Mwürzburg viene solitamente eseguita attraverso il sequenziamento, rispettivamente, dell'introne 4 e dell'esone 5. Poiché il sequenziamento è un metodo costoso e dispendioso in termini di tempo, abbiamo sviluppato un nuovo test per l'identificazione di queste varianti M-like. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato la messa a punto di nuovi saggi per la genotipizzazione di Mwhitstable e Mwhitstable con l’utilizzo di primer e sonde specifiche (Integrated DNA Technologies IDT); per eseguire entrambi i saggi è stato utilizzato lo strumento PCR Light Cycler® real-time 480 (Roche). Questo lavoro di tesi illustra la messa a punto dei nuovi saggi e dimostra che le frequenze alleliche delle due varianti nella popolazione selezionata con sospetto DAAT non sono così trascurabili: 0,017 (1,7%) per la variante Mwhitstable e 0,006 (0,6%) per la variante Mwürzburg. Una diagnosi tempestiva e corretta è importante per l'identificazione dei pazienti portatori di uno di questi alleli, e questo può essere ottenuto più facilmente utilizzando i nuovi test qui descritti. Inoltre, lo sviluppo dei nuovi saggi basati sull'utilizzo di sonde fluorescenti consentirà un'identificazione più rapida ed economica, aumentando così le prestazioni dell'algoritmo diagnostico.