Sviluppo di metodi di ingegneria cellulare e del substrato per la caratterizzazione della reologia cellulare

Introduction. Cardiovascular diseases (CVDs) are the leading cause of death globally. In the US, more than 900 000 people died of CVDs in 2016 and their prevalence is expected to increase by more than 30% within 2060. One of CVDs’ major representative is heart failure, a condition in which heart’s structure, function, and mechanical properties are altered both at macroscopic and cellular level. Cardiomyocytes’ contraction can be studied using Traction Force Microscopy (TFM). TFM is a technique that, given substrate’s mechanical properties and deformation, provides cells’ traction forces but not cells’ mechanical properties. TFM uses beads to study extracellular rheology, but to date, there is no counterpart to extract microrheological info from the inside of the cell. Genetically encoded multimeric nanoparticles (GEMs) are small bead-like objects that can be expressed by cells inside their cytoplasm. GEMs can be used to assess cells’ cytoplasm mechanical properties in a process called passive microrheology. Goal. We asked whether the beads in the substrate and inside the cells could be used together to simultaneously assess the rheology of both cells and substrate. In particular, we asked if GEMs motion could be used to extend TFM results, which are bound to cells’ border, to the inside of the cells. To try to combine TFM and GEMs, it is fundamental to first be able to handle them separately. For this reason, we decided to develop a platform that combines the physical and computational tools that are required for approaching this problem in the future. These tools comprehend a GEMs-engineered cell line, a TFM-suited hydrogel casting protocol, a TFM analysis pipeline, and a GEMs motion one. Results. Through the use of lentiviral particles, we genetically engineered a cell line (HEK293) to make it stably express GEMs. In addition, we created different GEMs-expressing positive clones so that, in the selected clone, expression levels would be comparable among cells. Then, we designed a fish gelatin (FG) hydrogel casting protocol and confirmed its TFM-suitability in terms of hydrogel height. After that, we seeded GEMs-expressing cells on two different physiological stiffness (1.5 and 5 kPa) FG hydrogels and acquired a series of microscopy images. We further developed a Python script to perform TFM analysis on beads and brightfield cells images and found that substrate’s displacement depends on its stiffness while cells’ traction forces don’t. Finally, we created another Python script to analyze Single Particle Tracking (SPT) results of GEMs videos and extracted GEMs diffusion coefficient statistical and spatial distribution. Conclusion. In the end, we managed to develop all the necessary tools that are needed to start investigating the GEMs integration in the TFM analysis. In the future, we will try to combine substrate (TFM) and cell (GEMs) rheology to extract cells’ mechanical properties. In particular, we will try to do so in cardiomyocytes to study their physiological and pathological mechanobiology and address CVDs.

Introduzione. Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte nel mondo. Negli Stati Uniti, più di 900 000 persone sono decedute a causa loro nel 2016 e si prevede che la loro prevalenza aumenterà di oltre il 30% entro il 2060. Uno dei principali rappresentanti delle malattie cardiovascolari è l’insufficienza cardiaca, una condizione in cui la struttura, la funzione e le proprietà meccaniche del cuore risultano alterate sia a livello macroscopico che cellulare. La contrazione dei cardiomiociti può essere studiata usando Traction Force Microscopy (TFM). TFM è una tecnica che, note le proprietà meccaniche e la deformazione del substrato, fornisce le forze di trazione applicate dalle cellule ma non le loro proprietà meccaniche. TFM utilizza le beads per studiare la reologia extracellulare, ma ad oggi non esiste una controparte per estrarre informazioni microreologiche dall'interno della cellula. Le genetically encoded multimeric nanoparticles (GEMs) sono piccoli oggetti simili alle beads che possono essere espressi dalle cellule all'interno del loro citoplasma. Le GEMs possono essere utilizzate per valutare le proprietà meccaniche del citoplasma delle cellule in un processo chiamato microreologia passiva. Obiettivo. Ci siamo chiesti se le beads nel substrato e all'interno delle cellule potessero essere utilizzate insieme per valutare simultaneamente la reologia sia delle cellule che del substrato. In particolare, ci siamo chiesti se il movimento delle GEMs potesse essere utilizzato per estendere all'interno delle cellule i risultati di TFM, i quali sono limitati al bordo delle cellule. Per provare a combinare TFM e le GEMs, è fondamentale prima saperli maneggiare separatamente. Per questo motivo, abbiamo deciso di sviluppare una piattaforma che combini gli strumenti fisici e computazionali necessari per affrontare questo problema in futuro. Questi strumenti includono una linea cellulare ingegnerizzata con le GEMs, un protocollo di realizzazione di hydrogel adatti a TFM, una pipeline di analisi di TFM e una per il movimento delle GEMs. Risultati. Attraverso l'uso di particelle lentivirali, abbiamo ingegnerizzato geneticamente una linea cellulare (HEK293) per farle esprimere in maniera stabile le GEMs. Inoltre, abbiamo creato diversi cloni positivi che esprimono le GEMs in modo che, nel clone selezionato, i livelli di espressione fossero comparabili tra le cellule. Poi, abbiamo ideato un protocollo per la realizzazione di hydrogel di gelatina di pesce e confermato la sua adeguatezza per TFM in termini di altezza dell'hydrogel. Successivamente, abbiamo seminato delle cellule che esprimono le GEMs su due hydrogel di gelatina di pesce di diversa rigidità fisiologica (1.5 e 5 kPa) e acquisito una serie di immagini al microscopio. Abbiamo poi sviluppato uno script Python per eseguire un’analisi di TFM su immagini delle beads e delle cellule e abbiamo trovato che lo spostamento del substrato dipende dalla sua rigidità, al contrario delle forze di trazione delle cellule. Infine, abbiamo creato un secondo script Python per analizzare i risultati del Single Particle Tracking sui 5 video delle GEMs e abbiamo estratto la distribuzione statistica e spaziale del loro coefficiente di diffusione. Conclusione. Alla fine, siamo riusciti a sviluppare tutti gli strumenti necessari per iniziare a studiare l’integrazione delle GEMs nell’analisi di TFM. In futuro, proveremo a combinare la reologia del substrato (TFM) e della cellula (GEM) per estrarre le proprietà meccaniche delle cellule. In particolare, proveremo a farlo nei cardiomiociti per studiarne la meccanobiologia fisiologica e patologica e affrontare le malattie cardiovascolari.