Studio della composizione biochimica delle Vescicole Extracellulari attraverso Spettroscopia Raman nel tumore al seno

The characteristics and role of extracellular vesicles (EVs) represent an innovative sector of research that still needs to be explored further. The main function of EVs consists in intercellular communication, influencing physiological and pathological processes and it has now been demonstrated how EVs deriving from tumor cells influence the tumor microenvironment and tumor growth by being vehicles of tumor-specific molecules. Consequently, there is growing interest in investigating the potential use of EVs as circulating biomarkers for diagnostic purposes. This thesis, in particular, focuses on the study of the possible role of EVs as a biomarker for breast cancer, which today represents one of the main causes of death from female tumors, and where an early diagnosis allows for the implementation of timely treatments with a decisive improvement of clinical outcomes. To this end, 34 breast cancer patients (BC) and 30 healthy controls (HC) were enrolled during the thesis. In the thesis work, first of all, the protocols for extracting nanoparticles from human plasma were applied through the use of differential and density gradient ultracentrifuge. In this specific case from human plasma. This work made it possible to obtain pure samples on which to carry out the experimental characterization techniques suggested by ISEV (The International Society for Extracellular Vesicles). The first part of the thesis involved a subgroup of ten subjects (5 BC and 5 HC), from which not only EVs were extracted, but also another type of nanoparticles present in human plasma, such as lipoproteins. In particular, the work focused on the comparison between different classes of EVs defined on the basis of their size (largeEVs and smallEVs) and the main classes of lipoproteins: VLDL, LDL and HDL. In this part of the work I focused on defining the biochemical profile of each nanoparticle through the use of Raman spectroscopy, an optical technique that allows obtaining information on the composition of the sample without the use of any reagent or marker. Through this work, we were able to identify a distinctive biochemical profile of each class that can be used to distinguish the fractions extracted from plasma and validate the extraction methods conducted. The second part, however, concerned the study of extracellular vesicles using Raman Spectroscopy (RS), in order to verify possible statistically significant differences in the biochemical profile between BC EVs and HC EVs. In this way it was possible to use Raman spectroscopy to define a fingerprint of the pathology, paving the way for the investigation of the possible role of EVs as circulating biomarkers.

Le caratteristiche e il ruolo delle vescicole extracellulari (EVs) rappresentano un settore della ricerca innovativo ed ancora da approfondire. La principale funzione delle EVs consiste nella comunicazione intercellulare influenzando processi fisiologici e patologici ed è stato ormai dimostrato come le EVs derivanti dalle cellule tumorali condizionano il microambiente tumorale e la crescita del tumore essendo dei veicoli di molecole specifiche del tumore. Di conseguenza, c'è un crescente interesse nell'indagare sul potenziale utilizzo delle EVs come biomarcatori circolanti per scopi diagnostici. Questa tesi, in particolare, si concentra sullo studio del possibile ruolo delle EVs come biomarcatore per il tumore al seno, che oggi rappresenta una delle principali cause di morte per tumori femminili, e dove una diagnosi precoce permette di attuare delle cure tempestive con un deciso miglioramento degli outcome clinici. A tal fine, durante la tesi sono stati arruolate 34 pazienti affette da tumore al seno (BC) e 30 controlli sani (HC). Nel lavoro di tesi, prima di tutto, sono stati applicati i protocolli di estrazione delle nanoparticelle dal plasma umano attraverso l’uso dell’ultracentrifuga differenziale ed in gradiente di densità. In questo caso specifico dal plasma umano. Questo lavoro ha permesso di ottenere dei campioni puri sui quali svolgere le tecniche sperimentali di caratterizzazione suggerite dall’ISEV (The International Society for Extracellular Vesicles). La prima parte della tesi ha interessato un sottogruppo di dieci soggetti (5 BC e 5 HC), dei quali sono stati estratti non solo le EVs, ma anche un altro tipo di nanoparticelle presente nel plasma umano, come le lipoproteine. In particolare, il lavoro si è concentrato sul confronto tra diverse classi EVs definite sulla base della loro dimensione (largeEVs e smallEVs) e le principali classi di lipoproteine: VLDL, LDL ed HDL. In questa parte del lavoro mi sono concentrata sulla definizione del profilo biochimico di ciascuna nanoparticella attraverso l’uso della spettroscopia Raman, una tecnica ottica che permette di ottenere informazioni sulla composizione del campione senza l’uso di alcun reagente o marcatore. Tramite questo lavoro, si è riusciti ad identificare un profilo biochimico distintivo odi ogni classe che può essere usato per distinguere le frazioni estratte dal plasma e convalidare i metodi di estrazione condotti. La seconda parte, invece, ha riguardato lo studio delle vescicole extracellulari tramite la Spettroscopia Raman (RS), per poter verificare possibili differenze statisticamente significative nel profilo biochimico tra le EVs dei BC e le EVs degli HC. In questo modo è stato possibile usare la spettroscopia Raman per definire un fingerprint della patologia, aprendo la strada all’indagine del possibile ruolo delle EVs come biomarcatori circolanti.