La perdita del cromosoma Y causa instabilità genomica e alterazioni nella risposta al danno al DNA

Y chromosome is the male specific chromosome and is primarily involved in the regulation and development of male sexual characteristics. The loss of Y chromosome (LOY) has been found to occur during the aging process and has been observed in complex age-related diseases such as cancer, cardiovascular diseases and neurodegenerative diseases. The role of Y chromosome in human physiological and pathological conditions, and its function in sexual dimorphism are the subjects of our studies. Therefore, in my laboratory a human syngeneic cell model of ARPE-19 (untransformed male retinal epithelial cells) has recently been generated, where the Y chromosome has been eliminated by CRISPR-Cas9 technology. Karyotype analysis of Y-depleted ARPE-19 isolated clones showed the absence of Y chromosome (45 X,-Y) and no translocations of Y-derived fragments; however, a percentage of cells displays a random chromosome loss (40-44 X,-Y). These data suggested that the absence of Y chromosome may increase chromosomal instability. In my thesis I have therefore tried to clarify if and how the Y chromosome contributes to preserve genomic integrity. Through immunofluorescence analysis we have shown that LOY induces the loss of genetic material (lagging chromosomes) during mitosis and a higher percentage of micronuclei formation in interphase, confirming genomic instability and demonstrating defects in DNA segregation. Since chromosomal instability may be due to alterations in DNA damage response pathways (DDR), a complex mechanism that regulates the repair of DNA lesions, we analyzed how Y-negative cells respond to treatment with genotoxic agents. We observed that some DDR proteins levels and their respective phosphorylations are modulated by the absence of Y chromosome, both before and after treatment with genotoxic agents. In addition, 30 minutes after neocarzinostatin treatment, we observed that the accumulation γH2AX foci, one of the main markers of DDR, decreased in Y-depleted cells compared to WT cell line, thus highlighting defects even in the initial stages of DDR. We then extended the study of Y chromosome role in the DDR to cancer cells, using the lung adenocarcinoma A549 cell line and its Y-negative derived clone A549-E3, and we investigated the levels and phosphorylation of the same proteins analyzed in ARPE-19. The results confirmed that the absence of Y chromosome also modulates the levels DDR factors in cancer cells. Finally, we observed that both untransformed and tumor Y-depleted cell lines have a greater ability to form colonies than WT cell lines after etoposide treatment, indicating that LOY reduces sensitivity to chemotherapy agents both in normal and cancer cells. In conclusion, our data indicates that loss of Y chromosome increases genomic instability and alters DDR pathways in both normal and cancer cells.

Il cromosoma Y è uno dei cromosomi sessuali presenti negli individui di sesso maschile, ed è principalmente coinvolto nella regolazione e nello sviluppo dei caratteri sessuali maschili. La sua perdita (loss of chromosome Y; LOY) è stata riscontrata nelle cellule durante il processo di invecchiamento ed è stata osservata nelle malattie complesse legate all'età, come cancro, malattie cardiovascolari e neurodegenerative. Il ruolo del cromosoma Y, in condizioni fisiologiche e patologiche umane, e la sua funzione nel dimorfismo sessuale sono oggetto degli studi del nostro laboratorio. Pertanto, è stato recentemente generato in laboratorio un modello cellulare umano singenico di ARPE-19 (cellule epiteliali di retina maschile) in cui il cromosoma Y è stato eliminato tramite la tecnologia CRISPR-Cas9. Le analisi del cariotipo delle ARPE-19-Y-deplete hanno dimostrato che tutti i cloni isolati sono mancanti del cromosoma Y (45 X,-Y) e che non sono presenti frammenti o traslocazioni del cromosoma maschile su altri cromosomi; tuttavia, è presente una percentuale di metafasi, che mostrano anche l’assenza casuale di altri cromosomi (40-44 X,-Y). Questi dati hanno suggerito che l’assenza del cromosoma Y possa aumentare l’instabilità cromosomica. Nel mio lavoro di tesi ho quindi cercato di chiarire se e come il cromosoma Y contribuisca a preservare l’integrità genomica. Mediante analisi di immunofluorescenza abbiamo dimostrato che l’assenza del cromosoma Y causa la perdita di cromosomi durante la mitosi e una più alta percentuale di micronuclei nelle cellule in interfase, confermando l’instabilità genomica e dimostrando difetti nella segregazione del DNA. Dal momento che l’instabilità cromosomica può essere dovuta ad alterazioni nei pathway di risposta al danno al DNA (DNA damage response; DDR), un complesso meccanismo che regola la riparazione delle lesioni al DNA, abbiamo analizzato come le cellule senza Y rispondano al trattamento con agenti genotossici, osservando che i livelli e la fosforilazione di alcune proteine della DDR vengono modulati dall’assenza del cromosoma Y in seguito a trattamento con agenti genotossici. Inoltre, a 30 minuti dal trattamento con neocarzinostatina, abbiamo osservato un minor accumulo di foci di γH2AX, uno dei principali marcatori della risposta al danno al DNA, nelle cellule senza cromosoma Y, evidenziando così difetti anche nelle fasi iniziali della DDR. Abbiamo poi esteso lo studio del ruolo del cromosoma Y nella DDR a un modello tumorale, utilizzando la linea cellulare di adenocarcinoma polmonare A549 e un clone da essa derivato, A549-E3 senza cromosoma Y, e abbiamo analizzato i livelli e la fosforilazione delle medesime proteine analizzate nelle ARPE-19. I risultati hanno confermato che l’assenza del cromosoma Y altera la DDR anche in cellule tumorali. Infine, abbiamo osservato che i modelli cellulari non trasformati e tumorali senza il cromosoma Y hanno una maggiore capacità di formare colonie rispetto alle linee cellulari di controllo in seguito a trattamento con etoposide, indicando che la perdita del cromosoma Y riduce la sensibilità ai trattamenti con chemioterapici sia nelle cellule normali che tumorali. In conclusione, i nostri dati indicano che la perdita del cromosoma Y aumenta l’instabilità genomica e altera i pathway della risposta al danno al DNA sia in cellule normali che tumorali.