Valutazione del Binding di Potenziali Ligandi dell'Enzima Batterico LsrK tramite Spettrofotometria di Fluorescenza e Dicroismo Circolare

L’antibiotico-resistenza rappresenta uno dei principali problemi per la sanità pubblica a livello mondiale, attestandosi quale principale causa di morte nel prossimo futuro. Nel corso dell’evoluzione i batteri hanno sviluppato diverse strategie basate su vari meccanismi di resistenza contro l’azione dei più comuni agenti antibatterici. Tra quest’ultime, il biofilm, una struttura lipopolisaccaridica in cui i batteri si aggregano in comunità organizzate, costituisce una barriera che protegge i batteri da fattori fisici e chimici, inclusi i farmaci antimicrobici. Inoltre, all’interno del biofilm, grazie alla capacità di comunicare mediante lo scambio di piccole molecole segnale, i batteri sono in grado di agire come una comunità, il che conferisce loro una resistenza adattativa all’ambiente che altrimenti non avrebbero in forma planctonica. Questo meccanismo di comunicazione, noto come Quorum Sensing (QS), è in grado di regolare l’espressione di geni coinvolti in processi patogeni come appunto la formazione e la stabilizzazione della matrice del biofilm. Tra le nuove strategie farmaceutiche messe in atto al fine di contrastare l’antibiotico resistenza, lo sviluppo di nuove entità in grado di neutralizzare il QS e la formazione del biofilm, rappresenta una promettente alternativa. Inoltre, non esercitando un diretto effetto battericida e aumentando la suscettibilità dei batteri agli antimicrobici e all’azione del sistema immunitario, non eserciteranno una marcata pressione evolutiva prevenendo così lo sviluppo di ulteriori resistenze. Una delle linee di ricerca in essere all’interno del MedChemLab del Dipartimento di Scienze del Farmaco coordinato dalla Prof.ssa Simona Collina, presso il quale ho svolto il presente lavoro di tesi, ha come obiettivo lo sviluppo di nuove small molecules in grado d’inibire la formazione del biofilm attraverso il quenching del QS. In particolar modo, queste molecole sono disegnate quali inibitori dell’enzima LsrK, una chinasi batterica che, mediante la fosforilazione dell’autoinduttore-2 (S)-4,5-diidropentan-2,3-dione (S-DPD), è in grado di innescare il QS sia in batteri Gram-positivi che in batteri Gram-negativi. La mancata fosforilazione dell’S-DPD mediante l’inibizione dell’enzima LsrK porta al blocco della trascrizione dell’operone lsr coinvolto nell’autosostentamento del QS e nella formazione del biofilm. Il presente lavoro di tesi si colloca in questo ambito e si concentra principalmente sulla valutazione del potenziale antibiofilm di alcuni potenziali ligandi dell’enzima LsrK sviluppati nel MedChemLab. I composti sono stati sottoposti a un test cellulare per verificare la loro attività antibiofilm in ceppi batterici di S. aureus e P. aeruginosa, scelti come modelli per le specie batteriche Gram-positive e Gram-negative. Per i composti più performanti la vitalità e la crescita batterica è stata valutata al fine di verificare che il loro effetto sia dovuto all'inibizione del QS piuttosto che da un'azione antimicrobica diretta. Infine, la capacità dei composti di interagire con il target è stata determinata mediante due tecniche biofisiche ortogonali quali il dicroismo circolare (CD) e la spettroscopia di fluorescenza intrinseca dei triptofani (TFS). I risultati ottenuti dal CD hanno evidenziato un cambio conformazionale della proteina a seguito dell’aggiunta dei composti in esame, indice di un’interazione tra i ligandi e la proteina. Questi risultati sono stati confermati dagli studi di TFS, dai quali si è osservata una riduzione della fluorescenza intrinseca di LsrK a seguito della titolazione della proteina con concentrazioni crescenti di composto. Ulteriori studi atti ad investigare più approfonditamente l’attività anti-QS e l’interazione a livello molecolare tra i composti identificati e la proteina LsrK sono tuttora in corso.