Sviluppo di un setup sperimentale e di una pipeline di analisi per la valutazione dell'efficacia antitumorale di farmaci in sferoidi di glioblastoma

Il glioblastoma (GBM) è un tumore cerebrale aggressivo per il quale non esiste una cura efficacie, pertanto è urgente identificare nuovi trattamenti. I recettori Sigma (SR) sono stati identificati come promettenti bersagli terapeutici. RC-106, composto recentemente sviluppato, è un modulatore dei SR con attività antiproliferativa che ha mostrato un effetto citotossico nell'intervallo micromolare (IC50=50-64μM) in colture bidimensionali (2D) di GBM. Prima di avanzare verso sperimentazioni in vivo, è fondamentale caratterizzare ulteriormente l'efficacia di RC-106 in modelli tumorali in vitro. Gli sferoidi sono colture in vitro tridimensionali (3D) che stanno emergendo come una piattaforma promettente per la modellizzazione del cancro. Essi, infatti, modellizzano più fedelmente le caratteristiche del tumore in vivo e la risposta al trattamento osservata in topi xenograft, rispetto alle colture 2D. Tuttavia, attualmente manca un metodo di valutazione quantitativo e robusto della crescita tumorale e dell'efficacia dei farmaci negli sferoidi. In questo lavoro, è stata sviluppata una pipeline integrata per valutare l'efficacia del composto RC-106 in sferoidi di GBM. Essa include la definizione di protocolli standardizzati per la generazione di sferoidi, l'analisi dei dati grezzi derivanti dagli esperimenti condotti e, infine, la loro modellizzazione matematica. Sono stati condotti tre esperimenti in cui sono stati generati sferoidi dalla linea cellulare U87- MG di GBM in piastre con fondo tondo Ultra Low-Attachment (ULA) da 96 pozzetti e trattati con due concertazioni di RC-106 (30μM e 40μM). Inoltre, gli sferoidi sono stati esposti a diverse concentrazioni di dimetilsolfossido (DMSO), utilizzato come veicolo per sciogliere il farmaco, per valutare eventuali effetti citotossici. Gli sferoidi sono stati monitorati per 14 giorni mediante l’acquisizione di immagini in campo chiaro, analizzate per estrarre parametri morfologici, come il volume. Sono stati effettuati test di vitalità cellulare e acquisite immagini in fluorescenza per la sua valutazione. Successivamente, è stato applicato il modello Simeoni, modello matematico che descrive l’inibizione della crescita tumorale (TGI) da parte di un farmaco antitumorale, alle serie temporali relative ai volumi degli sferoidi in presenza e assenza di trattamento al fine di caratterizzare l'effetto di RC-106 negli sferoidi di GBM. La ricostruzione 3D della struttura degli sferoidi ha richiesto l'implementazione di un algoritmo di segmentazione di immagini di serie temporali, elaborate tramite il software di rendering ReViSP. È stato dimostrato che in assenza di trattamento, il volume degli sferoidi segue un profilo di crescita esponenziale, mentre l'effetto del trattamento provoca una riduzione delle dimensioni degli sferoidi dipendente dalla concentrazione del farmaco. L’analisi modellistica ha portato allo sviluppo di un modello TGI in grado di descrivere l’effetto del trattamento sulla crescita. Inoltre, dai parametri del modello è stata ricavata una stima della concentrazione minima (Ct= λ0/k2) necessaria per garantire l'eradicazione del tumore che risulta consistente con l'intervallo di concentrazione efficace identificato su colture cellulari 2D di U87-MG. Infine, dall’analisi delle immagini in fluorescenza è emerso che il decadimento dei volumi delle cellule danneggiate degli sferoidi è paragonabile a quello ricavato dai dati di fluorescenza rossa. Ciò ha ulteriormente confermato l'affidabilità del modello identificato e della procedura sperimentale adottata.