Sintesi e caratterizzazione di molecularly imprinted nanogels per il riconoscimento specifico di un epitopo di MUC1

This project is focused on the synthesis of molecularly imprinted polymers (MIPs) for the specific recognition of the peptide sequence PDTRP. Both im-printed and non-imprinted polymers (NIPs) are synthesized in the physical form of nanogels (NGs) by a thermal initiated free radical co-polymerization. In this regard, two methods are employed: the dispersive solid-phase and the free tem-plate synthesis (high dilution polymerization). In the dispersive solid-phase synthesis, the peptide PDTRP is immobilized through its N-terminal group on magnetic nanoparticles (MNPs), bearing car-boxylic groups, by NHS-EDC coupling. The amount of the template immobi-lized on MNPs is estimated by a fluorometric test using Fluorescamine and re-sulted to be around 17 µmol per gram of MNPs. Further, the magnetic nanopar-ticles are characterized by Dynamic Light Scattering (DLS) and thermogravi-metric techniques. Both methods confirmed that the nanoparticles are effective-ly functionalized at each modification step. The polymerization mixture in water includes N-isopropylacrylamide (NIPAM), N-tert-butylacrylamide (TBA), N-(3-aminopropyl)-2-methylacrylamide hydro-chloride (APMA) and acrylic acid (AA) as hydrogen bonding, hydrophobic, positively and negatively charged functional monomers, respectively, in com-bination with N,N’-methylene-bis-acrylamide (BIS) as cross-linker. The func-tional monomers are properly selected to interact with the chemical groups of the template PDTRP. To this mixture, a small amount of N-fluoresceinylacrylamide is added to make NGs detectable by visible fluores-cence (λ excitation =495nm and λ emission= 530nm). In order to identify the optimum formulation, two sets of NGs, that differ only for the ratio of the two charged monomers, are prepared in the free template synthesis. The first contains only APMA at 10 mol % and the second includes both APMA and AA at 5 mol %. The size and zeta potential of the synthesized NGs are determined by DLS. The data acquired by DLS show that NGs of the second set are smaller and present a narrower particle size distribution than those of the first set. Moreover, the specificity of the MIPs to PDTRP is assessed by a binding assay, based on the detection of the unbound NGs by fluorescence. The test is performed both in water and in PBS. From the results of these exper-iments, MIPs without AA show a higher specificity to the template than MIPs with AA. For this reason, further studies of selectivity towards the template are performed only on the NGs where AA is lacking. Additionally, the composition with only APMA as charged monomer is applied to the dispersive solid-phase synthesis of NGs. Comparing the correspondent NGs obtained by the two different strategies, in both cases there is a significant difference in the percentage of binding between NIPs and MIPs, indicating MIPs specificity for the peptide sequence PDTRP. Notably, for the NGs obtained by the dispersive solid-phase synthesis, this gap increases, due to the lower level of the non-specific interactions of the related control (NIPs). Therefore, from this preliminary screening of different types of NGs, the mate-rial selected as the most specific to the template is represented by the MIPs syn-thesized in dispersive solid-phase and composed of APMA 10 mol % as charged monomer.

Questo progetto riguarda la sintesi di molecularly imprinted polymers (MIPs) per il riconoscimento specifico della sequenza peptidica PDTRP. Sia i polimeri imprinted che quelli non imprinted (NIPs) sono sintetizzati nella forma fisica di nanogels (NGs) attraverso una copolimerizzazione radicalica termo-iniziata. Per questo scopo, vengono usati due metodi: sintesi in fase solida dispersa e con templato libero in soluzione (polimerizzazione ad alta diluzione). Nella sintesi in fase solida dispersa, il peptide PDTRP viene immobilizzato at-traverso il suo gruppo ammino terminale su nanoparticelle magnetiche funzio-nalizzate con gruppi carbossilici, tramite la reazione di coupling con NHS-EDC. La quantità di templato immobilizzato sulle particelle magnetiche è stimata tra-mite un test fluorimetrico con Fluorescamina e risulta essere pari a 17 µmol per grammo di particelle. Inoltre, le nanoparticelle magnetiche sono caratterizzate attraverso tecniche analitiche, quali Dynamic Light Scattering (DLS) e analisi termogravimetrica. Entrambi i metodi hanno confermato che le nanoparticelle sono effettivamente funzionalizzate ad ogni step di modificazione. La miscela acquosa di polimerizzazione include N-isopropilacrilammide (NIPAM), N-terz-butilacrilammide (TBA), N-(3-amminopropil)-2-metilacrilam-mide cloridrato (APMA) e acido acrilico (AA) rispettivamente come monomero funzionale formante legami a idrogeno, idrofobico, carico positivamente e ne-gativamente, in combinazione con N,N'-metilen-bis-acrilammide (BIS), come cross-linker. I monomeri funzionali sono selezionati appositamente affinchè possano interagire con i gruppi chimici del templato PDTRP. A questa miscela, si aggiunge una piccola quantità di N-fluoresceinilacrilammide per ottenere na-nogels rilevabili tramite fluorescenza visibile (λ eccitazione = 495 nm, λ emis-sione= 530 nm). Per identificare la composizione ottimale, due serie di NGs, che differiscono so-lo per la proporzione dei due monomeri carichi, sono preparati tramite sintesi con templato libero in soluzione. La prima contiene solo APMA a 10 mol %, mentre la seconda include sia APMA che AA, ciascuno in una quantità pari a 5 mol %. Il diametro particellare e il potenziale zeta dei NGs sintetizzati vengono determinati attraverso la tecnica DLS. I dati acquisiti da quest’analisi mostrano che i nanogels della seconda serie sono più piccoli e presentano una distribu-zione dimensionale più stretta rispetto a quelli della prima serie. Inoltre, la spe-cificità dei MIPs per il peptide PDTRP viene valutata attraverso un test di bin-ding, basato sulla rilevazione tramite fluorescenza dei nanogels non legati al substrato immobilizzato sulle particelle magnetiche . L’analisi viene condotta sia in acqua che in tampone fosfato. In base ai risultati di questi esperimenti, i MIPs senza AA mostrano una maggior specificità nei confronti del templato ri-spetto ai MIPs con AA. Per questa ragione, si eseguono ulteriori studi di seletti-vità per il templato soltanto sui NGs della prima serie. Inoltre, la composizione comprendente esclusivamente APMA come monomero carico viene applicata alla sintesi dei NGs in fase solida dispersa. Confrontando i NGs con la stessa composizione (solo APMA come monomero carico) ottenuti dalle due diverse strategie di sintesi, in entrambi i casi risulta esserci una significativa differenza nella percentuale di legame tra NIPs e MIPs, indice della specificità dei MIPs per la sequenza peptidica PDTRP. Per i NGs ot-tenuti tramite sintesi in fase solida dispersa, questa differenza risulta più marca-ta grazie all’inferiore livello di interazioni non specifiche del relativo controllo (NIPs). Quindi, in base a questi preliminari test sulle diverse tipologie di NGs, il mate-riale selezionato come il più specifico nei confornti del templato di interesse è dato dai MIPs sintetizzati in fase solida dispersa e composti da APMA 10 mol % come monomero carico.