Sviluppo di un modello ex vivo di Pseudomyxoma peritonei per l’identificazione di nuovi approcci terapeutici.

Pseudomyxoma peritonei (PMP) is a rare malignancy that originates from mucinous appendiceal tumors and affects about 1-2/1.000.000 patients per year. PMP is characterized by gross accumulation of mucinous tumor in the peritoneal cavity and has a non-metastatic grown pattern. Currently, complete cytoreductive surgery combined with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (CRS-HIPEC) represents the standard of care for treating patients with PMP. The development of a pro-inflammatory microenvironment appears to be related to the development and progression of the disease. In particular, both pro-inflammatory (such as IL-6, TNF, IL-1) and pleiotropic (IL-4, IL-9) cytokines could be involved in the generation of a specific inflammatory environment that promotes mucin accumulation and the spread of neoplastic cells in the peritoneum. In addition, inflammation could affect Wnt/Notch pathways, leading to an aberrant goblet-like phenotype. However, the biological events the sustain PMP development remain poorly understood and could be elucidated by an in vitro 3D-culture system capable of reproducing the main features of PMP. In recent decades, tumor-derived organoids (TDO) have demonstrated their prominent role in oncology research because they better reflect the main characteristics of the native tissues than classical 2D cell culture models. Our goal was to develop an ex vivo model of PMP that retains the main biological characteristcs of PMP. We developed eight TDO cultures derived from eight different PMP patiens. The TDO were grown with different culture media supplemented with specific factors mimicking the pro-inflammatory microenviroment usually observed in PMP, and the best medium condiction was selected for each TDO cultures. Next, we characterized the genetic landscape and histological features of the obtanined TDO terms, demonstrating that PMP-derived TDO were able to recapitulate the main characteristics of their tissues of origin. Regarding PMP disease, one of the major unmet clinical need is the establishment of a gold standard for HIPEC treatment. Therefore, we treated TDO with the most common HIPEC schemes used in clinical practice. We observed that the response to treatments differed among the TDO cultures, demonstrating the clincal value of organoids in defining tailored therapy. However, the TDO model still fails to represent the sourrounding microenvironment. Recent advances in cancer research have made it possible to obtain decellularized extracellular matrices (d-ECM) from patients that could be used as the most representative scaffold on which to implant TDO cultures. In this context, We sought to obtain an ex vivo model of PMP that closely recapitulates the microenvironment in which PMP develops and comprises d-ECM repopulated with PMP-derived TDO. To pursue this aim, we removed the cellular component of the ECMs using detergents and enzymatic methods. Analyses of dECMs showed that the procedure maintained the specific characteristics of their original tissue, including distribution, localization, and architectural organization. Next, we repopulated the dECMs with PMP-derived TDO and found that TDO colonized the d-ECM, with a grow pattern similar to that observed in patient-derived samples. This allowed us to develop a three-dimensional model that reproduces the neoplasm, which can be used to study the development of the disease as a whole and to develop new therapeutic strategies in a biologically relevant context, to personalize treatments and increase their efficacy.

Lo Pseudomyxoma peritonei (PMP) è una neoplasia mucinosa rara che colpisce l’appendice caratterizzata dalla rottura dell’appendice con conseguente riversamento di mucina e cellule epiteliali neoplastiche nella cavità peritoneale. Il PMP presenta un elevato stato infiammatorio, per questo motivo le citochine pro-infiammatorie (IL-6, TNF, IL-1) e le citochine pleiotropiche (IL-4, IL-9) sembrano svolgere un ruolo determinante per lo sviluppo e la progressione della malattia. L’infiammazione inoltre può portare ad alterazioni nelle vie di trasduzione del segnale che regolano l’omeostasi delle cellule epiteliali a livello della cripta del colon, come le vie di Wnt/Notch, inducendo un fenotipo secretorio aberrante. La terapia di elezione a cui vengono sottoposti i pazienti affetti da PMP è una strategia basata sulla chirurgica citoriduttiva (CRS) associata alla chemioterapia intraperitoneale effettuata in regime di ipertermia (HIPEC). I meccanismi biologici che sottendono allo sviluppo dello PMP rimangono, ad oggi, poco chiari e conosciuti. Inoltre, la bassa incidenza della malattia e la bassa cellularità che caratterizzano il tumore, rendono complesso lo sviluppo di modelli cellulari in vitro di PMP, per lo studio della patologia. Negli ultimi venti anni l’impiego di organoidi sviluppati a partire da tessuto tumorale di paziente (TDO) ha permesso di ottenere dei modelli cellulari in vitro in grado di ricapitolare fedelmente le caratteristiche biologiche, strutturali e funzionali dei tessuti di origine. Lo scopo della mia tesi di laurea è stato sviluppare un modello preclinico ex vivo di PMP, costituito da organoidi derivati da tessuto tumorale dei pazienti con i quali valutare la risposta ai trattamenti farmacologici. Sono stati utilizzati gli organoidi per riprodurre la lesione metastatica derivata da PMP, usando come impalcatura per la crescita porzioni di matrice extracellulare del tumore dalle quali è stata prima rimossa la componente cellulare. Durante il mio internato di tesi, sono state sviluppate otto linee di TDO derivate da otto diversi pazienti con PMP, utilizzando terreni di coltura differenti che ricapitolavano le caratteristiche specifiche del microambiente tumorale infiammatorio del PMP applicando una strategia di semina combinata. La differenza di crescita dei TDO in terreni di coltura diversi ha permesso di sottolineare come ciascuna linea di TDO fosse dipendente da stimoli pro-infiammatori diversi. Sono state poi caratterizzate le otto linee a livello genetico e morfologico e, confrontandole con il loro tessuto di origine, è stato dimostrato che ne riproducono le caratteristiche. Dopo aver selezionato il terreno di crescita maggiormente indicato per ciascuna linea di organoidi, i TDO sono stati trattati con gli schemi farmacologici comunemente impiegati nella pratica clinica per eseguire l’HIPEC ed è stato evidenziato come la risposta al trattamento sia paziente-specifica. Recentemente sono state messe a punto delle metodiche per ottenere matrici decellularizzate (dECM) ricavate da pazienti, che possono essere utilizzate come impalcature per la crescita dei TDO, ottenendo un modello in vitro in grado di ricapitolare meglio le lesioni neoplastiche. Sulla base di questi dati è stato sviluppato un modello preclinico ex vivo di PMP utilizzando come impalcatura per la crescita dei TDO ricavati da pazienti porzioni di matrice extracellulare dalle quali è stata rimossa la componente cellulare (3D-dECM). Sono stati testati diversi protocolli per il ripopolamento di queste matrici con i TDO, e sono state identificate le condizioni migliori per fare aderire i TDO alla 3D-dECM. In questo modo si è potuto mettere a punto un modello tridimensionale che riproduce la neoplasia, che potrà essere utilizzato per studiare lo sviluppo della patologia e per definire gli schemi di trattamento più efficaci in maniera paziente-specifica.