Ricerca e sviluppo di metodologie per indagare il ruolo della DNA polimerasi λ nel processo ALT

Nella maggioranza dei tumori, l'integrità dei telomeri è mantenuta attraverso l'attività della telomerasi. Tuttavia, in circa il 10% dei casi, la stabilità dei telomeri viene preservata tramite un meccanismo alternativo di allungamento dei telomeri (ALT). Le cellule ALT si caratterizzano per elevati livelli di eventi di ricombinazione telomerica, per una notevole eterogeneità e fluttuazione nelle lunghezze dei telomeri e per la presenza di esameri telomerici non canonici. Un tratto distintivo delle cellule ALT è la presenza abbondante di DNA telomerico extra-cromosomiale (ECTR), e in particolare di C-circles, strutture parzialmente a singolo filamento costituite principalmente dalla sequenza del filamento telomerico ricco in C. Queste strutture costituiscono un marcatore ampiamente riconosciuto dell’attività del meccanismo ALT. Sebbene questo processo non sia completamente caratterizzato, vi è un crescente consenso sul ruolo centrale che rotture a doppio filamento (DSB) derivanti dal collasso della forca replicativa ne siano la causa scatenante. Fino ad ora, l'unica DNA polimerasi associata al meccanismo ALT è stata Pol δ, una polimerasi replicativa. Tuttavia, polimerasi specializzate sono spesso richieste in diverse vie di riparazione di danni al DNA. Le polimerasi della famiglia X, sono coinvolte in diverse vie di riparazione, come il BER e il NHEJ. All'interno di questa famiglia, Pol λ partecipa alle vie di riparazione di DSB c-JNHEJ e MMEJ colmando brevi gap a livello della lesione (Crespan et al., 2012; van Loon et al., 2017). Di conseguenza, questo enzima, come altri legati alla riparazione di DSB, è candidato per u ruolo di rilevanza nel processo ALT. In accordo con questa premessa, nel nostro laboratorio Pol λ è stata collegata al fenotipo ALT, mostrando di giocare un ruolo nella sintesi di C-circles (Mentegari et al., 2021). Tuttavia, lo studio del ruolo di Pol λ nell’ALT e non solo è limitato dall'assenza di anticorpi specifici impiegabili in analisi di immuno-fluorescenza e immuno-precipitazione. In questo lavoro, oltre ad una caratterizzazione preliminare del ruolo di diverse polimerasi coinvolte nella riparazione di DSB nell’attività ALT, ci siamo dedicati allo sviluppo di linee cellulari che permettano l'analisi approfondita del ruolo di questa proteina. In particolare, abbiamo impiegato la metodologia CRISPR-Cas9 come strumento di genome editing per creare linee cellulari U2-OS knock-out per Pol λ e knock-in per una forma fluorescente dell’enzima. Purtroppo abbiamo verificato come la fusione di Pol λ con GFP porti a tossicità cellulare, obbligandoci a scartare questo strumento di indagine. Al contrario, siamo riusciti a isolare diversi cloni knock out per Pol λ. Le cellule U2-OS mantengono i loro telomeri tramite meccanismo ALT. Di conseguenza, le cellule Pol λ-/- da noi realizzate saranno essenziali per osservare gli effetti a lungo termine dell’assenza di questa proteina nel mantenimento telomerico e, in generale, nel meccanismo ALT.